骨病理学(osteopathology)主要研究骨骼、关节、韧带及其相关软组织疾患所致的各种骨病变;同时亦涉及骨与关节的肿瘤和瘤样病变、血液循环障碍或一些全身性疾患所致的继发性骨和关节病变。

近年来,随着医学各分支的迅速发展,先进的检测手段如免疫组织化学、电子显微镜、分子杂交等被应用于对疾病的病因和病变进行深入探讨,其中发展最迅速的是骨组织形态计量学(bone morphometry)和分子骨病理学(molecular osteopathology),前者是用形态计量方法来测量骨的形态变化,探讨早期的骨组织病理变化;后者是将分子生物学技术应用于骨病理研究的新兴领域,它的发展和应用使许多代谢性骨病的研究深入到了分子水平,在阐明发病机制和分子病变方面发挥了重要作用。

【骨标本的制作与特殊病理学技术】

 骨标本分为脱钙和不脱钙两种:临床骨组织活检标本常需经脱钙处理后制成切片。但是对于一些代谢性骨疾病,如原发性或继发性骨质疏松及甲状旁腺功能亢进性骨病等,除了需要观察组织形态学改变外,常常还需测定骨形态计量学参数,这时则需要制作不脱钙的骨组织切片。

骨病理分析

免疫组化/原位杂交/流式细胞仪/聚合酶链反应和图像分析用于骨病理分析:

免疫组织化学技术

免疫组化在骨组织病理中的应用还相对较少,主要原因是骨切片的制作程序烦琐,抗原性在该过程中常常受到破坏。为得到较好的免疫组化染色效果,制片过程中应注意合理选择固定剂和脱钙剂。低温对细胞抗原有保护作用,对耗时长的操作如固定应于低温下(4℃)进行。低温塑料包埋方法制备的切片抗原性得到有效保护(不脱钙骨切片,图2-9-18),因而不仅可用于形态计量学研究,还在免疫组化中有满意的效果,但时间太长是其缺点。

不脱钙骨切片 不脱钙骨切片 不脱钙骨切片

不脱钙骨切片

注:A:MMP-13在成骨细胞中呈阳性表达(免疫组化SABC法,AEC显色,×400)。B:MMP-8在成骨细胞中呈阳性表达(免疫组化SABC法,AEC显色,×200)。C:骺板处软骨细胞呈IGF-1蛋白阳性表达(免疫组化SABC法,AEC显色,×400)

原位核酸分子杂交技术

原位杂交是利用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待检的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,对复合物进行显色显示细胞内杂交信号。与免疫组化相比,其特异性和敏感性更强;细胞定位更为可靠;能反映细胞与细胞间遗传信息改变的差异及相互关系。原位杂交与免疫组化技术相结合,使得对基因转录和蛋白质表达两个水平进行调控分析成为现实。

原位杂交技术在骨代谢病理中,用于检测各种细胞因子或受体的mRNA在骨组织细胞中的分布情况和表达水平。对表达量少的生物分子的mRNA还可进行原位RT-PCR扩增,再行检测。原位杂交对骨标本的要求同免疫组化基本一致,但更强调组织的新鲜性,因此做原位杂交时应优先选择新鲜的骨标本。

骨组织原位核酸分子杂交

骨组织原位核酸分子杂交

注:IGF-1 mRNA在成骨细胞中呈阳性表达(原位杂交,AEC显色,×400)

组织微阵列技术

组织微阵列(microarray technology)又称组织芯片,同基因芯片类似,它是一张载玻片上包含数十至上千个整齐排列的组织标本。组织芯片不仅克服了传统病理学方法和DNA 芯片技术中存在的某些缺陷,而且可与传统的病理技术、组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR和原位DNA合成等技术相结合,能快速地在原位组织中对基因的DNA进行扩增,检测mRNA的表达丰度和蛋白质的表达,具有高通量的优点,能在短时间内从一个微阵列中获取大量信息。因此将组织芯片与基因芯片结合应用,有力地扩大了信息获取范围。

组织芯片用于骨代谢研究中,从纵向上看可将动物或人的不同发育阶段的骨标本集中在一张切片上,在统一的质量监控下观测相关基因表达水平的变化,分析骨代谢标志物如骨钙素、骨保护素、Ⅰ型胶原蛋白、骨形态生成蛋白和金属基质蛋白酶等在骨发育中的阶段性表达。横向则可比较各种骨代谢疾病模型与正常对照或干预组间有哪些生物分子标记物的改变。所以将组织芯片技术移植到代谢性骨病学的病理研究中,可以大大增加一次性分析所获得的信息量,加快了研究速度,而且可以使结果的准确性明显提高。

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