如何痰染片和阅片?

一、经典染色方法各种教科书和各个版本的规程上都详细叙述。这里介绍经过本章节作者改良后的革兰染色方法,试剂使用书籍上介绍的经典革兰染色液,将碘液改为Albert碘液对倍稀释,脱色液使用3∶7(v/v)的丙酮酒精溶液,复染液改为1∶5(v/v)稀释的石炭酸复红。染色过程:滴加结晶紫染色液覆盖涂片染色1分钟,蒸馏水冲洗;甩掉多余水滴,滴加碘液覆盖涂片1~2分钟媒染(室温低于20℃时作相应延长),蒸馏水冲洗;甩掉多余水滴,滴加丙酮酒精液脱色时,需不断晃动玻片,使液体迅速均匀覆盖涂片,1~2秒后倒掉,不冲洗,再次滴加脱色液,晃动覆盖,脱色3~4秒后倒掉,仍不冲洗,又滴加脱色液进行第三次脱色,此时缓慢晃动玻片,脱色4~6秒后蒸馏水冲洗;甩掉多余水滴,滴加稀释复红,晃动玻片混匀染液后覆盖涂片复染1分钟,蒸馏水冲洗,自然干燥或滤纸吸干后上油镜。目前,各种商品化染色液层出不穷,质量良莠不齐,配方均进行了不同程度的改动,其说明书要求的染色操作流程各不相同。然而,为了达到最佳染色效果,使用新厂家的染色液时,必须进行流程摸索。除了使用混合菌进行质控以外,还应该使用痰涂片、脓液涂片、血涂片,以及粪便涂片进行实际染色效果验证,找出一个最佳染色流程。流程确定后,微生物室所有成员必须严格执行该流程,不允许任意改动。

二、痰涂片阅片能力的培养,是一项逐渐积累的过程,需要经过长年累月反复的强化训练才能造就。良好的训练方案应将阅片与次日的菌落观察相结合,逐渐建立起理性认识。另外,由于痰涂片中的细菌经过抗生素和人体免疫因子(白细胞溶酶、补体、抗体)的影响后,其形态与对数期纯培养物不太一致,需要总结各种常见细菌的形态变异特点。使用药敏试验中出于亚抑制状态下的细菌涂片染色镜检能快速总结经验。所谓亚抑制状态细菌即是指,处于抑菌环边缘或比MIC低一个梯度浓度孔中的细菌。

阅片技巧:
  1. 先在低倍镜下寻找适合阅片的区域,该区域脓细胞呈团块状分布,集中而不稠密,且周围无鳞状上皮细胞或无大量呈团状分布的细菌球。
  2. 认真搜寻脓细胞胞质中有无吞噬的细菌或真菌孢子,注意细菌/真菌的染色排列特征(如成双、链状、并行、分枝、葡萄状、放射状、文字形、栅栏状、条索状等),菌体特征(如大小、粗细、长短、扭曲);有无真菌菌丝团块或者放线菌菌丝被结节状分布的炎性细胞包裹。
  3. 区别吞噬与黏附的方法:位于细胞核上的细菌为黏附;细菌与细胞核不在同一层面上的为黏附;多种不同形态和染色特征的细菌纠结成球状者为黏附;链球菌同一条链,部分在细胞上,部分在细胞外时为黏附;真菌在脓细胞中未产生占位现象的为黏附;G+细菌染色深浅与胞外菌完全相同时考虑为黏附。胞内菌体周围有一圈微弱狭窄淡染区的为吞噬;由于细胞的位阻效应导致胞内菌染色相对于胞外菌偏淡,加之受溶酶体的破坏,胞内G+细菌染色呈现斑驳不均现象;胞内G杆菌菌体具有膨大趋势;真菌孢子会将细胞核挤到细胞的边缘,形成月牙形。
  4. 观察细菌与细胞分布的相关性,假如某种形态的细菌在片中,细菌多的地方细胞少,而细胞多的地方细菌少,那么这种形态的细菌多为定植菌;反之即使没有吞噬,也应考虑为感染菌;对于产荚膜的细菌,吞噬现象的观察比较困难,采用分布相关性(即伴行行为)比较容易找到感染菌。另外,对于产生荚膜的细菌,只要认真搜寻,对于荚膜低表达或荚膜丢失的菌体,也能在胞内发现。
  5. 丝状真菌和诺卡菌以及其他放线菌由于菌体较大,其产生的炎性反应为包裹显现,即真菌菌丝团块或者G+放线菌菌丝被结节状分布的大量炎性细胞包裹。
  6. 特殊细菌的辨认:流感杆菌在脓细胞内为G细小杆菌,灰尘样分布,往往一个细胞中吞噬大量的细菌;卡他莫拉菌(以及其他莫拉菌)为G双球菌,胞外细菌量大,而胞外菌分布较少,且无荚膜;鲍曼不动杆菌为G球杆菌,眼镜形,由于产荚膜,其分布特点是胞内菌较胞外菌少;金黄色葡萄球菌在痰涂片中容易辨认,胞内成对或葡萄状排列,染色比胞外菌偏淡;铜绿假单胞菌为G细而刚直的杆菌,散在排列;黏液性铜绿则在胞外形成明显淡染的黏液层,大量细菌聚集成片状分布;肺炎克雷伯菌为G粗大杆菌,成对排列,胞外菌多有厚重荚膜;其他肠杆菌科细菌及气单胞菌为G规则杆菌,形态与大肠埃希菌类似;肺炎链球菌为G+矛尖状双球菌,胞外菌有厚重荚膜,而胞内菌染色偏淡且斑驳不清,容易漏诊;嗜麦芽寡养单胞菌为G细长杆菌,并行排列形成筷子样,菌体往往有弯曲;化脓性链球菌在涂片中为G+长链状排列的球菌,菌体为正圆形,比葡萄球菌小,胞内菌染色偏淡,易出现斑驳。隐球菌在痰涂片中为G+大球形真菌孢子,周围有不着色的荚膜,在涂片中染色较淡,易漏诊,胞内菌着色斑驳,或形成不着色的球形空泡,在细胞内具明显的占位,细胞核被排挤到边缘形成月牙形。

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