移植物体外净化处理

AL、恶性淋巴瘤、MM等恶性血液病患者AHSCT后治疗失败的主要原因是复发。一方面大剂量放/化疗后宿主体内残存的白血病细胞或其他肿瘤细胞是复发的根源;另一方面自体移植物中肿瘤细胞污染也是恶性血液病AHSCT后复发的重要原因。因此,为了降低AHSCT的复发率,有必要在移植前通过强烈巩固治疗及预处理进行体内净化,同时对自体移植物通过体外处理清除肿瘤细胞,以提高移植疗效。肿瘤细胞污染所致的复发与污染细胞数量和不同肿瘤生物学特性相关。国际骨髓移植登记处(IBMTR)非随机对照研究表明恶性淋巴瘤患者移植物体外净化后进行AHSCT,复发率可以降低15%。其他多数研究也表明移植物经过体外净化处理对临床有益。这些研究鼓舞学者们进行种种净化策略包括体内外的净化研究。

APBSC中残存肿瘤细胞

虽然采集的PBSC中含有肿瘤细胞的浓度较BM中低,但是许多研究表明PBSC中污染的肿瘤细胞仍是引起移植后复发的重要原因。由于采集的PBSC数量明显多于BM,因此回输的细胞量是关键。对13例MM患者的PBSC和BM标本进行研究,采用定量PCR分析免疫球蛋白(Ig)重链可变区序列以评估肿瘤负荷。结果表明,BM中中位肿瘤细胞比例为0. 74%,明显高于PBSC(中位0. 0024%),但是在回输的HSC中含有的肿瘤细胞总数两者差异不明显。因此,不能认为APBSCT后疾病复发率会低于ABMT。

移植物体外净化方法

目前体外净化移植物肿瘤细胞的最主要方法包括药物学、免疫学如单克隆抗体(mAbs)的阴性分选、免疫吸附、免疫磁珠、流式细胞分选技术的阳性分选、体外培养、细胞毒性T细胞治疗及病毒介导的净化等。

药物学净化

用于体外净化的实验性药物不少,但能应用于临床的药物则较少,多为Cy的衍生物。4-氢过氧环磷酰胺(4- HC)是第一个用于BM净化的药物,它是Cy在体内经肝脏微粒体转化的主要毒性产物4-羟环磷酰胺的类似物。Asta- Z(Mafosfamide)是另一种活化的Cy的衍生物,水解后变成4- HC而发挥作用。4- HC在美国应用较广泛,而Asta- Z则主要用于欧洲。

4- HC对白血病细胞有杀伤作用,它对肿瘤细胞的毒性呈剂量依赖性,并使定向祖细胞如粒、巨噬细胞集落形成单位减少高达99%。药物净化的主要不利因素是移植后造血重建延迟,AML患者BM应用4- HC净化后进行ABMT,其中性粒细胞中位植入时间为29天,而未净化BM者为22天。目前多数学者认为药物净化法主要对化疗药物敏感的白血病细胞有效,这类患者同样可以通过大剂量联合化疗在体内清除白血病细胞,因此,现在已经很少应用体外药物净化法。

免疫学净化

由于单克隆抗体(mAbs)对肿瘤细胞的特异性,使其成为能清除恶性肿瘤细胞的一种有效方法。但肿瘤细胞抗原表达的异质性,使人们为达到有效清除恶性肿瘤细胞的目的而采用多种mAbs的鸡尾酒疗法。单克隆抗体并不具备直接的细胞毒性,必须依赖补体或免疫毒素等方能发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。目前常用的免疫学净化方法有补体介导的细胞毒法、免疫毒素法、免疫磁珠法等。

1)补体介导的细胞毒法:单抗与相应靶细胞表面抗原结合后,激活补体的经典途径使靶细胞溶解破坏,清洗去除溶解的细胞,从而使正常造血细胞得以纯化。该法简单,安全,无需特殊设备,费用低,是以往最常应用的临床净化方法。提高补体介导细胞毒的净化效能的有效方法是研究针对不同的肿瘤细胞、不同的抗原决定簇的特异性单抗加补体的最佳条件。Racadot等研究了12种单抗在补体的参与下净化自体BM的最佳条件,认为:单抗剂量在细胞数为107时应为1~10μg、细胞悬液中的细胞浓度应小于3×107/ml、多种单抗联合应用的净化效果优于单一单抗。

2)免疫磁珠法:免疫磁珠法已广泛用于实体瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、MM和淋巴瘤的体外净化处理。针对B淋巴瘤细胞的mAbs 1个循环能去除淋巴瘤细胞1. 9~2. 8个对数级,当3种MoAbs联合应用,1个循环净化的效率增加至3. 3个对数级,2个循环净化处理可去除5个对数级B淋巴瘤细胞。有学者研究2种不同免疫磁珠微粒的净化效果,发现1个循环对肿瘤细胞杀伤是3. 1个对数级,明显好于单个免疫磁珠的净化效果。但2个循环分别应用一个磁珠的净化效果与2种磁珠微粒联合应用的净化效果无明显差异,均大于4. 5个对数级。3种或4种mAbs联合免疫磁珠联合净化作用更佳。近十年来,临床最常用的是磁性细胞分选(MACS)技术,属于免疫磁珠法的一种,能快速、大容量获得目的细胞。通过CliniMACS自动分选仪最多可以处理(4~12)×1010个细胞,分选或去除6× 108~1×1010个标记细胞,例如CD34、CD133、CD90 或CD8等细胞。CD34+细胞阳性选择净化已广泛应用于恶性血液病和实体瘤的自体移植中,可清除2~4个对数级的恶性肿瘤细胞。与补体介导的细胞毒法相比,免疫磁珠法具有净化效率高,操作时间短的优点,磁珠没有批次间的生物学差异等优点。

3)免疫毒素介导的细胞毒净化法:由于免疫毒素介导的杀伤机制不同于化疗药,故对于化疗耐药的细胞可用此方法。天然的强毒素如蓖麻毒素和白喉毒素等的A链和B链经二硫键相连,称为全毒素。单独的A链称半毒素,毒力不如全毒素强,A链有细胞毒性,B链则与细胞膜上的半乳糖残基结合,将细胞毒素带入溶酶体中,不可逆灭活60S核糖体或核糖体延长因子(EF2),抑制蛋白质的合成。抗肿瘤单抗与毒素结合后杀伤力增强,甚至单抗分子上只要结合一个毒素分子便有杀伤能力。免疫毒素是以特异性单抗为载体,毒素为弹头,使毒蛋白有良好的导向性,对靶细胞发挥定向的杀伤作用。体外研究发现该方法可杀伤6个对数级的肿瘤细胞。

4)其他方法:HSC体外净化其他方法有脉冲电场法、悬浮免疫微珠法、病毒净化法、高温、低温等物理净化法。脉冲电场法对流动的HSC通过脉冲电场可有效地净化骨髓瘤细胞而不损伤HSC功能。悬浮免疫微珠法将低密度的聚丙烯微珠预先包被在大鼠抗小鼠mAbs上,然后加入抗B细胞mAbs,孵育一定时间,采用该方法对16例B细胞恶性疾病患者自体BM进行净化,结果MNC的回收率为75%,髓系祖细胞的回收率为83%。病毒净化法是一种新的净化策略,DNA病毒如基因工程腺病毒载体被用作提供前药激活酶或在肿瘤细胞中选择性表达野生型p53而达到破坏肿瘤细胞起到体外净化的效果。

体外净化的临床研究

药物学净化

药物学净化在AML患者中研究的最多,在NHL和骨髓瘤患者中也有研究。在高危AML患者中应用4- HC或马磷酰胺(mafosfamide)体外净化,可使部分患者ABMT后获得长期无病生存(DFS)。一项多中心研究表明,应用4- HC净化的AML患者ABMT后无白血病生存率(LFS)为56%,而未净化者为31%。EBMT回顾性分析了387例在CR1期进行AHSCT的儿童患者的疗效,发现体外净化组患者的复发率明显下降(净化组30%±4%vs.未净化组43%±3%,P=0. 04)。Abdallah A等应用马磷酰胺对98例AML患者移植物进行体外净化,结果ABMT后患者中性粒细胞恢复中位时间为27天,随访11. 7年,30%患者长期DFS。Feller N等对54例AML的患者行药物学净化联合物理净化,其方法为:脂质体依地福新(ET- 18- OCH3,对白血病细胞有选择性杀伤作用)联合低温保存或高温处理(42℃),结果发现体外联合净化可使白血病细胞减少1个以上对数级,对于MRD大于0. 05%以上患者收益较大。

免疫学净化

应用免疫学净化法研究最多的疾病是NHL,其他的疾病有MM、ALL、AML、乳腺癌、小细胞肺癌以及神经母细胞瘤等。诸多研究已证明此方法的安全性,并且对造血重建没有明显的延迟作用。但目前尚缺乏前瞻性随机对照研究确认去除隐性或显性肿瘤细胞是否会提高患者移植后DFS。

一、免疫磁珠法

免疫磁珠法,尤其是CD34阳性分选技术已广泛应用于AL、MM和恶性淋巴瘤患者移植物体外净化。

1)急性白血病:CD34、CD133免疫磁珠阳性分选可清除2~4个对数级的白血病细胞。Feller等对165例初治AML进行了免疫表型分析,发现CD34和(或)CD133不表达者为32%,弱表达者为20%,并对这部分患者中的11例的自体移植物进行了CD34+细胞或CD133+细胞阳性分选,结果分选后移植物中白血病细胞数下降3~4个对数级而正常干细胞中位回收率为50%。因此,CD34+细胞和CD133+细胞阳性分选可以使近50%的AML患者受益。为了使另外一半AML患者也从分选净化中获益,该作者研究了CD90阳性分选净化的作用。作者检测了119例AML和MDS患者,结果发现42例(35%)共表达CD34和CD90。在60岁以下患者(此部分患者适于行AHSCT)仅有23%为CD90+,即有77%的患者可采用CD90+细胞分选,分选后移植物中AML细胞下降了2. 8~4个对数级。因此,CD90阳性分选净化可能对大多数60岁以下AML有效。

2)NHL:在NHL患者AHSCT治疗中,CD34+细胞的阳性选择及B细胞标志性抗体的阴性选择应用较广泛。Williams等比较了回输净化HSC的270例及回输未净化HSC的224例NHL患者行AHSCT的疗效,发现净化组患者总生存率(OS)明显提高。IBMTR回顾性分析了131例移植物体外净化及597例移植物未净化的滤泡性淋巴瘤(FL)患者AHSCT疗效。经多因素分析发现,净化组患者比未净化组患者RR明显降低(5年时两组RR分别为43%和58%),虽然移植相关死亡率(TRM)未降低,但净化组OS及DFS均明显提高(P = 0. 03),体外净化为AHSCT后影响RR、无进展生存(PFS)、OS的独立预后因素。日本学者Imai Y等对48例NHL患者的移植物行CD34+细胞阳性选择,结果采集物中位纯化率和回收率分别为93. 3%、72. 2%,移植后患者的中性粒细胞及血小板恢复中位时间分别为10天、14天,移植后2年所有患者的PFS及OS分别为37. 3%、68. 3%,这些研究均提示NHL患者移植物CD34+细胞的阳性选择体外净化对AHSCT疗效可能具有一定的作用。

以上研究均为非随机临床试验,2003年欧洲进行了一项前瞻性随机临床试验。该研究中130例复发的FL患者,化疗后达CR或PR的患者随机分组,其中32例采用免疫磁珠法净化移植物后行AHSCT,33例患者采用未净化移植物行AHSCT,24例患者接受传统化疗。结果,大剂量化疗后AHSCT可以明显提高复发滤泡淋巴瘤(FL)患者的PFS,但移植物净化并不影响NHL患者的OS。本研究虽然为随机试验,但样本数较少,还需要前瞻性大样本随机对照试验比较净化与不净化HSC的疗效差异。

3)CLL:多项研究已初步证实HSC净化能降低CLL患者AHSCT后的RR。Isidori等对10例复发、难治CLL患者的采集物行CD133+细胞阳性选择免疫磁珠体外净化,中位净化纯度高达94. 8%,T细胞与CD19+CD5+细胞中位净化效能分别达3. 85、2. 8个对数级,HSC回输后所有患者均未发生造血与免疫系统重建延迟。中位随访28个月,5例CR,3例PR,仅1例患者疾病进展。随后,Dreger等人通过一项非随机、单中心的Ⅰ/Ⅱ期临床研究初步证实了双次HSC体外净化的可行性和有效性。该研究对20例高危CLL患者的采集物采用CD34+细胞免疫磁珠阳性选择和抗CD19/20/23/37抗体标记的免疫磁珠阴性选择进行双次体外B细胞去除,结果净化后CD34+细胞纯度高达98. 8%(89. 1%~99. 8%),CD19+CD5+CLL细胞中位净化效能达5(4. 1~6)个对数级。移植后所有患者均未发生植入延迟,中位随访20(6~29)个月,17例CR。最近,DFCI等报道了10余年来137例CLL患者(90%为IgVH基因突变阴性)接受体外干细胞净化后AHSCT结果,6年OS可达58%。

然而,移植物中过度去除淋巴细胞,尤其是既往接受过多次氟达拉滨(Flud)或阿仑单抗治疗者可导致移植后免疫重建延迟。Altes等报道10例CLL患者接受移植物双次体外B细胞去除后AHSCT结果,移植后13个月内有3例死于感染,另有2例患单纯疱疹病毒感染,均提示存在免疫系统重建延迟。

4)MM:MM细胞不表达CD34,自体HSC的CD34+阳性选择可能对MM患者有益,但多项研究证明对于MM患者,CD34+细胞阳性选择并不能提高患者AHSCT后生存率。Vescio R等对131例接受AHSCT的MM患者移植物行CD34+细胞阳性选择,中位随访12个月,结果体外净化虽然降低了肿瘤细胞的污染,但并未提高患者移植后EFS和OS,主要是MM患者CD34+阳性选择不能降低移植后RR。2007年,Bourhis JH等通过对111例MM患者的前瞻性随机临床研究,也发现CD34+细胞阳性选择虽然能降低移植物2个对数级的肿瘤细胞,但也不能降低RR,不能改善OS。

二、免疫毒素法

应用免疫毒素净化移植物的临床试验较少。7例高危T- ALL和6例T细胞NHL应用抗CD7蓖麻毒素A净化后进行ABMT,骨髓细胞与浓度为10-8mol/L免疫毒素共孵育,经克隆生长试验或植入时间研究均表明免疫毒素对HSC祖细胞没有明显影响。14例T- ALL患者BM应用抗CD5和CD7共轭2种完整的蓖麻毒素,同时加4- HC进行净化。尽管净化效果很明显,但是移植后仍有9例患者复发,而且大多数在HSCT后短期内复发,提示此类高危患者复发的原因可能是由于大剂量化疗失败所致。

三、补体介导的细胞毒作用

1982年Boston移植小组首次报道以J5或J5和J2加兔补体净化ALL患者的骨髓,结果,24例患者移植后有8例无病生存达4~44个月。以后随着本方法的进一步研究和应用,使这一方法逐渐成熟。Sallan等对19例CR2 和CR3的ALL患者骨髓移植物经单抗J5和J2加兔补体净化后进行ABMT,中位随访20个月,结果6例患者仍CR,7例复发,而5例于缓解期死亡。Ball等用抗粒细胞分化抗原单抗PM81(抗CD15)和AML- 2- 23(抗CD14)加兔补体对138例CR1~CR3 的AML患者骨髓净化后进行ABMT,其中预处理为CY/TBI(全身照射)的CR1患者3年和5年DFS分别为71%和57%,CR2/3患者均为23%;预处理为白消安(BU)/Cy的CR1患者3年和5年DFS均为45%,CR2/3患者分别为31%和28%。中国医学科学院血液病医院移植中心也曾对2例T- ALL患者BM采用抗CD7单抗+补体,1例common- B- ALL患者BM采用抗CD10单抗+补体体外净化,结果B- ALL患者NR,3个月后死亡,而2例T- ALL患者CCR达10年以上。以上结果也提示补体介导的溶血作用体外净化移植物的有效性。

体内净化作用的研究

体外净化会导致HSC丢失,而且实施过程费时费力,采用单克隆抗体体内净化可以避免以上缺点。体内净化应用的单克隆抗体应该是高效、低毒、患者可耐受的治疗性抗体。体内净化的优势是易于实行、无需细胞处理实验室而且不仅在干细胞采集期间可应用,在患者全程治疗期间均可应用,还可在AHSCT后重复应用。目前体内净化的缺点是现有的合适抗体有限,仅能针对一种抗原。

CD20抗原

CD20抗原仅表达于前B和成熟B细胞,而不表达于HSC和造血细胞系统的其他细胞,抗CD20单抗可作为体内净化剂去除采集的HSC中污染的肿瘤细胞。利妥昔单抗(rituximab)是基因工程人鼠嵌合单克隆抗体,也是研究最广泛的抗CD20单抗,现已被认为是DLBCL和FL标准治疗方案的组成部分。

Arcaini等报道了一个前瞻性、多中心Ⅱ期临床试验结果,64例晚期复发/难治FL患者中,应用巢式PCR检测bcl- 2/IgH重排阳性的患者38例,体内净化方案包括2~4个疗程的3周免疫治疗与化疗(利妥昔单抗375mg/m2第1天;VCR 1. 4mg/m2第2天;Cy 400mg/m2第2~6天)+4剂HD- Ara- C(2g/m2 q12h第2、3天)+2剂利妥昔单抗(375mg/m2第1、9天),结果在免疫治疗与化疗后33例患者BM PCR检测转为阴性,34例患者进行了PBSC的采集,其中33例采集物进行了PCR检测,全部为阴性,净化效果达100%,这是迄今为止FL患者免疫净化病例数最多的报道,移植后中位随访期3. 5年,41例仍处于CR,5年PFS为59%。并且,自体移植后bcl- 2基因重排(-)与持续临床缓解相关。此净化效果优于大剂量化疗的体内净化,后者的PCR转阴率为50%。

Magni等报道了28例初治MCL的前瞻性试验的10年随访结果,患者接受应用大剂量连续化疗+利妥昔单抗体内净化,利妥昔单抗(375mg/m2)共输注6次,结果接受检测的19例患者采集物全部PCR (-),转阴率100%。中高危组患者10年OS为68%,低危组患者为76%;10年EFS分别为34%和57%。以上研究表明,利妥昔单抗体内净化后行AHSCT可以使部分MCL患者得到治愈。

应用利妥昔单抗不影响干细胞采集的质和量,亦不影响回输后造血功能的恢复,也可以在AHSCT后应用。Hicks LK等2009年报道了一项前瞻性单中心研究,23例复发的FL患者以AHSCT联合利妥昔单抗体内净化后以利妥昔单抗维持治疗。结果,中位随访74. 2个月,可评价的13例患者中11例达持续分子生物学缓解,所有患者5年OS及PFS分别为78%、59%。移植后大部分患者出现长时间的低丙种球蛋白血症,但并未增加严重感染的发生率。

对于利妥昔单抗治疗效果不佳,及难治、复发的CD20阳性的NHL患者,可以应用核素标记的抗CD20单抗的放射免疫治疗;放射免疫治疗还可以作为预处理的组成部分应用于AHSCT,适用于因年龄≥60岁或先前用过放疗而无法用分次TBI的患者。Press OW等报道,52例复发B细胞NHL患者进行AHSCT,采用131I-托西莫单抗联合大剂量(HD)-依托泊苷(VP16)和Cy作为预处理方案,结果移植后2年的OS和PFS分别为83%和68%,比同期采用HD- VP16+Cy+TBI预处理后移植的患者的OS和PFS明显较长。

阿仑单抗

阿仑单抗为抗CD52单克隆抗体,CLL细胞表面高度表达CD52,阿仑单抗可有效清除骨髓及外周血中肿瘤细胞,甚至对于Flud耐药或p53基因突变的CLL患者仍然有效。因此,采用HDT后AHSCT治疗的CLL高危患者,阿仑单抗在AHSCT前应用有可能达到体内净化的效果,在AHSCT后维持治疗有可能清除微小残留病(MRD),从而提高疗效。在Montillo等进行的Ⅱ期临床研究中,34例患者采用阿仑单抗10mg 3次/周×6周行体内净化,结果CR率由35%提高到79. 4%,19例(56%)检测不到MRD。这说明阿仑单抗对CLL患者能起到体内净化作用。

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