破骨细胞培养存在诸多技术难题

成年动物的破骨细胞位于骨陷窝内,其数量少,难以分离。目前所用的破骨细胞一般取材于24小时内出生的鼠或出生不满10天的猪或兔,也可用胎儿的长骨。成年动物的破骨细胞培养一般采用管状骨,如产蛋母鸡的长骨。近年来又发展了由骨髓或骨髓瘤细胞株、脾细胞诱导破骨细胞形成技术,培养出来的破骨细胞只具有破骨细胞的部分功能。

将长骨纵形切开,用吸管轻轻吹打去除骨髓,用手术刀将内层骨质刮入培养液中,并用吸管吹打骨质碎粒,使细胞从骨粒中游离出来,静置30秒后转入37℃培养,30~60分钟后换液并洗去未贴壁细胞,镜下观察即可见破骨细胞贴壁。因胎鼠或其他小动物分离出的破骨细胞数目较少(1μm3组织中仅有2~3个),1次分离需要取材多只小动物。用胎鼠的颅盖骨做破骨细胞培养。切取薄层透明颅盖骨后,尽量除去筋膜和软骨,将其剪碎成1mm3大小的碎片,加入胶原酶消化;取第2个15分钟消化液培养。用骨髓培养时,需在骨髓中加诱导剂如1,25-(OH)2D、RANKL、CM-CSF(单核巨噬细胞集落刺激因子)等。骨髓可用注射器针头插入骨髓腔直接抽取。为了获得更高的转化率,可在骨髓培养中加入成骨细胞共同培养。

成人的破骨细胞培养取材于髂骨等处的骨松质,将骨松质剪碎后,用胶原酶消化2~5分钟,并用吸管吹打,不锈钢网过滤并去除胶原酶后置于骨片上培养。破骨细胞鉴定包括形态观察、TRAP及TrATPase染色、降钙素受体测定、骨片吸收陷窝观察及标记基因分析。

一、形态学观察

破骨细胞形态不一,刚分离出来时,大多呈不规则的圆形,贴壁后呈多角形、长条形、漏斗形、油煎蛋样,伸出多个伪足,体积大,直径约30~100μm。含有多核(与多核巨噬细胞难以区分)。

二、TRAP及TrATPase染色

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞的特异性标志酶,应用偶氮耦联组化分析法显红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物,偶氮副品红为显色剂,TRAP在酒石酸钾钠存在条件下将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚,AS-BI与显色剂结合在细胞胞质内呈红色沉淀,而胞核依然清晰可见(图1-3-7)。TrATPase是破骨细胞酸性磷酸酶的同工酶,对破骨细胞具有相对特异性。细胞固定后,放入含有ATP二钠盐、硫酸镁、硝酸铅、酒石酸钾钠的Tris-马来酸缓冲液内孵育。染出来的细胞形态同TRAP染色,酶活性部位呈棕褐色颗粒样沉淀,分布于整个胞质或胞质的大部分,细胞核呈阴性。

三、降钙素受体的测定

与巨噬细胞不同,破骨细胞及其前体细胞含有丰富的降钙素受体,结合位点大于106/细胞,因而是反映破骨细胞分化的特异性指标。应用免疫细胞化学染色法经ABL试剂反应和显色反应,呈橙黄色,苏木精复染后核呈淡蓝色。

破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色

破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色

注:破骨细胞呈“油煎蛋”样,胞质被染成红色,可见多个细胞核

四、骨片吸收陷窝的观察

将破骨细胞培养在薄的骨片上,骨片可来自猪或牛,厚度10~50μm,表面光滑且无菌处理。2~3天培养后,有活性的破骨细胞在骨片上形成明显的陷窝。扫描电镜观察,其基底留下粗糙不平的呈网状交织的胶原纤维,边界清晰,形态不规则。

五、 标记基因RNA分析

碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、降钙素受体、TRAP等均被认为是破骨细胞的标记基因,对细胞的RNA或蛋白进行分析,可以鉴定其是否表达这些基因。

六、抗骨吸收药物评价

主要包括:

  1. 破骨前体细胞转化为成熟破骨细胞的能力:培养的骨髓细胞可转化为成熟破骨细胞,某些药物可抑制骨髓细胞转化成成熟破骨细胞,从而通过减少破骨细胞的数目,达到抗骨吸收的目的;
  2. 骨片吸收陷窝:骨片吸收陷窝数是反映破骨细胞功能的直接指标,药物促进或抑制破骨细胞的骨吸收,可通过光镜下或共聚焦激光扫描显微镜计数单位面积骨片上的骨陷窝数来确定;
  3. 破骨细胞的凋亡率:测定破骨细胞凋亡率可作为破骨细胞药效评价的指标。多种方法可检测细胞凋亡,如电泳测细胞内DNA的梯形降解、共聚焦激光扫描显微镜检测细胞结构、流式细胞技术、DNA末端标记、内切核酸酶活力测定、凋亡相关基因表达等;
  4. 破骨细胞骨基质降解酶:破骨细胞能分泌许多降解酶,如基质金属蛋白酶9(MMP-9)能降解明胶和层粘连蛋白。可测定药物处理后MMP基因表达的变化而评价药物的抗骨吸收功能。

成骨细胞与破骨细胞混合/二维培养揭示调节机制:由于机体内成骨细胞与破骨细胞之间是密切耦联、相互作用的,单独的成骨细胞或破骨细胞培养不能代表体内真实的细胞生长状态,因此许多研究者尝试将成骨细胞与破骨细胞混合培养。利用带滤膜的双层培养板,既可将破骨细胞与成骨细胞置于同一体系中培养,又可将两种细胞区分开来,这对于研究一种细胞的表达产物对另一种细胞的影响具有重要价值。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/3393.html

小程序

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学