HER-2检测前的注意事项

目前,国内外一般采用免疫组化(immunohisto-chemistry, IHC)法检测HER-2受体蛋白表达状态,应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)和显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization, CISH)法检测HER-2基因扩增水平。

1.固定前组织处理

标本类型包括手术切除标本、粗针穿刺标本、冷冻后标本,标本自手术切除后应尽快固定。根据抗原决定簇对细胞自溶的耐受程度不同,延迟固定会导致不同程度的免疫原性丧失,而出现染色减弱或消失。根据《乳腺癌HER-2检测指南(2009年版)》,切除或穿刺的乳腺癌组织应在1小时内进行固定;如果组织较大,应将其间隔5~10mm切开,并用纱布或滤纸将相邻的组织片分开,以保障固定液充分渗透和固定。固定液的量应为组织体积的10倍。不宜用微波快速固定组织。

2.固定液的选择

甲醛溶液是一种价廉的、容易制备的固定剂,能够在各种条件下、以各种浓度稳定地对几乎所有组织发挥作用。它不是一种蛋白凝固固定剂,固定后的组织不会出现凝固组织团,细胞形态也不会因凝固物的形成而发生变形。然而,甲醛固定也存在不可避免的缺点。甲醛固定的原理是导致蛋白质之间、蛋白质与核酸之间形成交联,并可与钙离子形成共价键。正是交联和共价键的形成改变了蛋白质的三维结构并覆盖了抗原决定簇,使组织抗原性减低。尽管可以通过抗原修复解决,但要求检测系统足够敏感。此外,甲醛还是一种有毒物质,一种变应原和致癌剂,对它的处理也需要较高的费用。因此,近年来许多学者都在寻找能够取代甲醛的新型固定剂。乙醇固定是通过对蛋白质的迅速凝固而发挥作用,一些研究显示它对部分抗原的保存作用优于甲醛。有学者发现以甲醇为主要成分的固定剂UMFIX不仅能保存良好的组织形态,在保存生物大分子方面也优于甲醛。

尽管多种固定剂各有利弊,但许多关于IHC标准化的建议均强烈反对使用甲醛以外的固定剂。理由是:①尽管有些固定剂在保存抗原性方面优于甲醛,但由于无法像甲醛那样完好地保存组织形态而无法被广泛应用。②尽管某些固定剂固定的组织也可达到外观高质量的IHC染色,但可能呈现出不同的抗原免疫反应强度和模式。有学者发现乙醇或乙醇甲醛混合固定会过度增加HER-2检测的敏感性,如使非肿瘤上皮细胞明显着色,使阴性或2+的病例呈现更强的着色。③经过数十年的发展,不计其数的研究和病理学家的个人经验形成了肿瘤和非肿瘤病变的IHC表达特征的知识体系,这一体系构成了病理医师诊断疾病和对新抗体进行确定的基础,而这一体系几乎全部依据甲醛固定、石蜡包埋组织的研究结果。《乳腺癌HER-2检测指南(2009年版)》推荐使用磷酸缓冲液配制的4%中性甲醛固定液。

3.固定时间

甲醛的扩散系数为0.79,意味着它将以大概1mm/h的速度渗入组织。然而渗入并不等于固定。固定时间过短会中断甲醛固定过程,而在其后脱水过程中出现乙醇的凝固性固定,这会导致交联与凝固性固定不同程度的混合。尽管这样固定的组织在HE染色切片上看不出太大差别,但在IHC染色切片中会出现组织形态和染色的差异而成为IHC结果差异的重要来源。有学者认为,固定时间过长会导致交联过度形成,固定剂中的污染物也可能造成一些抗原的不可逆损伤,使染色强度过低或信号消失。《乳腺癌HER-2检测指南(2009年版)》指出,固定时间以6~48小时为宜,经以上方法处理的组织标本可作为理想的IHC、FISH和CISH检测和分析对象。

4.固定后组织处理:甲醛固定后,接着进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明以及石蜡包埋。

5.组织切片

(1)采用IHC染色的切片厚度以3~5μm为宜,FISH和CISH法以4~5μm为宜;切片在空气中略微干燥后应立即烤片(IHC为70°C,45~70分钟;FISH为63°C,过夜)。

(2)未染色切片置于室温不宜超过6周,以防抗原丢失。

(3)完成检测的切片,IHC和CISH可按常规长期保存;FISH结果应立即照相存档并将标本置于—20°C保存1年。

(4)3种方法均应有HE染色切片作为对照。

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