HER-2的检测方法

1.IHC

建议使用相关机构批准的抗体(试剂盒)。为保证检测结果的可靠性,在使用前必须经过严格的实验室内部和外部质量控制程序验证和(或)对比试验,并建立完善的实验室标准操作程序(SOP)。应严格按各试剂盒的标准程序进行染色,使用非生物素检测法和高质量的DAB显色液,以避免内源性生物素的影响。在显微镜下监控显色过程,避免过显色而造成很强的背景。在染色过程中,每一步都要充分洗涤,并始终保持切片潮湿。IHC自动染色系统更易达到标准化,但应进行严格的对比试验和程序优化。每一批次的IHC染色均需设阳性和阴性对照,经FISH或CISH检测阳性的浸润性导管癌可用作阳性对照。被检测切片癌旁组织中的正常乳腺上皮细胞是很好的阴性内对照。

2.FISH

(1)HER-2探针:建议使用相关机构批准的检测试剂盒。目前进行HER-2基因状态检测的探针绝大部分是同时含有HER-2基因(标记为橘红色荧光)和该基因所在的17号染色体着丝粒(CEP17,标记为绿色荧光)的混合探针。

(2)影响检测结果的因素

1)造成实验失败,结果不能判读:①细胞核被损坏,边界不完整;②组织过度消化,细胞核边界不完整,二脒基苯基吲哚(DAPI)染色浅;③组织消化不足,无信号。

2)不能计数分析细胞:①细胞核被切割得不完整,直径明显小于其他细胞;②细胞核重叠;③缺乏绿色或橘红色信号。

一旦发现染色结果未达到要求,则不能判读,必须重新制片和染色。

(3)对照

1)内对照:使用上述同时含有HER-2基因和CEP17的混合探针。杂交后的组织细胞中有≥75%的细胞核显示出双色信号时视为检测成功,并且橘红色、绿色信号互为对照,癌细胞与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为FISH检测失败:①对照标本未出现预期结果;②可计数信号<75%;③>10%的荧光信号存在于胞质内;④细胞核结构难以分辨;⑤有强自发荧光。

2)外对照:应选择FISH阳性和阴性的切片(或采用厂家提供的对照片)作为外对照。

3.CISH

(1)HER-2探针:建议使用相关机构批准的试剂盒。使用地高辛标记的探针,在4%中性缓冲甲醛固定、石蜡包埋组织切片上进行杂交反应,再用鼠抗地高辛抗体和辣根过氧化物酶抗鼠抗体进行免疫结合,DAB显色。

(2)影响检测结果的因素:①加热预处理的温度和时间;②消化时间的长短;③加热共变性时杂交液的蒸发;④杂交后洗涤是否干净;⑤苏木精对比染色的着色深浅。

(3)注意事项:①加热预处理的温度保证在98°C以上,最好完全煮沸,时间15分钟;②具体消化时间因组织的固定时间、固定方式和切片的厚度而异,建议消化时间5~30分钟;③杂交液滴加后必须覆盖杂交膜,再用封片胶密封;④杂交后的洗涤温度最低应在75°C以上,最高不超过80°C;⑤苏木精对比染色着色不可过深,否则会遮盖杂交信号。其中,最为关键和困难的是消化时间的掌握,消化不足会影响杂交效果,消化过度会破坏组织形态。

(4)对照:每次染色必须设立严格的阴性、阳性对照(试剂盒中有阴性、阳性对照片),被检测切片癌旁组织中的正常乳腺上皮细胞、间质细胞、淋巴细胞可作为阴性对照。

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