美国FDA明确要求,对治疗骨质疏松药物的啮齿类动物(rodents)实验研究需采用去卵巢大鼠和一种非啮齿类动物模型。

大鼠是使用最广泛的实验动物

美国FDA明确要求对治疗骨质疏松药物的动物实验研究需采用去卵巢大鼠和一种非啮齿类动物模型。啮齿类动物的共同优点是:

  1. 分布广,繁殖快,可大量提供,相对廉价;
  2. 体积较小,易于饲养管理;
  3. 成年大鼠许多部位的松质骨骨量可在一个较长的时期内保持稳定,这期间表现为丰富的骨形成和骨吸收,即骨重建,而且骨重建部位类似于人,这种骨重建的自然平衡是研究松质骨重建的合适条件;
  4. 大鼠与人类在骨代谢方面还有许多相似之处,如与人类相似的松质骨分布部位、重建功能和板层骨的骨小梁重塑能力、存在着随增龄而发生的骨丢失现象;
  5. 一些人体常规检测方法如骨生化标志物、BMD、组织形态学和生物力学测试都可应用于大鼠;
  6. 大鼠骨骼系统解剖与人类有众多相似之处,如股骨颈近端无骨膜覆盖等;
  7. 双侧卵巢切除后,可发生与妇女绝经后相似的松质骨结构改变;
  8. 生命周期较短(2~3年),比较容易观察到年龄因素对骨组织的影响。

大鼠模型的缺点是:

  1. 承重方式与人类不同;
  2. 12~24月龄后骨骺方完全闭合;
  3. 皮质骨内骨重建较罕见,骨皮质缺乏哈佛系统,不适于用大鼠来观察皮质骨的变化;
  4. 终身维持活跃的骨塑建;
  5. 骨骼内大多终生含有红骨髓,骨转换率较人类高;
  6. 没有脆性骨折发生,必须通过骨的力学实验来评价骨的脆性;
  7. 无自然绝经,但切除双侧卵巢可产生人工绝经;
  8. 体积较小,不允许反复及多处进行骨组织活检及大量采取血液标本;
  9. 药动学与人体不同。

实验用大鼠有远交系和近交系两种。远交系包括Wistar、Spraque-Dauley、Long-Evans和Holtzman等品种;近交系包括ACI、Brown-Norway、Fischer 344、Lewis和Wistar-Furth等品种。常用作骨质疏松动物模型的是Wistar、Spraque-Dauley、Holtzman和Fischer 344。大鼠自然寿命是2~3年,性成熟期为2~3个月,有明显的生长期和成年期,但性别不同,其生长期、成年期及骨骺闭合时间也不同。雄性大鼠软骨骨骺生长时间较雌性大鼠长,成年雄性大鼠30月龄时骨干骺端仍持续生长,骨生长静止时间也晚于雌性大鼠,所以雄性大鼠骨用于各种成人骨骼研究模型就存在一些困难,如骨生长期较长、骨峰值年龄不明确,而雌性大鼠无论在实验时机和实验周期上都比雄性大鼠有更多的优越性。另外,根据具体实验要求选择适当月龄的动物进行造模也是非常必要的。雌、雄大鼠股骨的钙含量和断裂强度在1~3月龄时增长很快,3~12月龄时增长变慢,12~27月龄时基本不变,30月龄时开始下降,而矿物质沉降速率、血清磷浓度和血清碱性磷酸酶活性在1~9月龄时迅速下降,9~30月龄维持在低水平基本不变。

故若是观察各种因素对肌肉骨骼系统生长的影响最好选幼龄大鼠,因为尽管2月龄大鼠性腺已基本发育成熟,但此时体重与骨骼长度、重量、BMD及骨钙含量等仍处于快速增长阶段,3月龄时性腺与内分泌系统才完全发育成熟,肌肉骨骼系统基本成型。雌性大鼠在6~9月龄时进入骨生长静止期,骨骺开始封闭,长骨停止生长,有足够的骨小梁重建,这是一个骨代谢相对稳定的阶段,到10月龄时达到峰值骨量,因此6~12月龄,特别是10月龄为复制成年绝经后骨质疏松模型的最佳年龄。12月龄以后一般被认为已进入老龄,21~24月龄以后由于雌激素缺乏,雌性大鼠乳腺肿瘤发病率上升,故不宜用于有关骨代谢方面的研究。

若要复制老年性骨质疏松最好选择16月龄以上大鼠,除非特别需要,一般不选用21月龄以后的大鼠作为造模动物。此外,无论选什么年龄的动物来复制骨质疏松模型,均应设立不加任何处理因素的本底对照(baseline control)以消除增龄等因素的影响。对于产仔后的雌性大鼠一般应避免选用。因为孕期和哺乳期大鼠由于钙的过度需要抑制了骨骼的正常发育,导致骨骼成熟不全,与未孕产鼠相比,发育程度差异较大,容易造成实验偏差。

成年雌性大鼠有规则的发情期,发情期时体内E2水平处于峰值,每4天有18小时的峰值时间;在15个月后可观察到骨松质有一些骨丢失现象;当不出现E2峰值时,标志“绝经”,骨松质丢失发生加快。雌性大鼠的卵巢切除以后,血清E2含量明显下降,子宫重量显著减轻,骨代谢活跃,骨转换增强,骨吸收大于骨形成,起初有一个快速的以骨松质丢失为主的阶段,骨松质的骨量减少,骨强度下降,较好地模仿了人正常绝经后高转换型骨质疏松发生的骨丢失。同时,去卵巢大鼠在骨量减少部位上,也表现出与人类很大的相似性。此外,切除卵巢的大鼠胃肠道对钙的吸收减少,肥胖对骨丢失有保护作用,以及对雌激素、他莫昔芬、二膦酸盐、甲状旁腺激素和降钙素等药物的反应均与人类有相似之处。雌激素补充治疗能抑制骨转换和骨丢失,也与绝经后妇女对雌激素补充疗法的反应相一致。

在卵巢切除的大鼠实验中,由于雌激素的减少可引起体重增加,而体重与BMD呈正相关,这就可能掩盖了雌激素缺乏后骨丢失加快引起的BMD降低。这可以通过与假手术组成队饲养或限制饮食来解决,但任何一种限制饮食的方法都可能使更多的骨松质丢失,并加快骨质疏松的发展。像其他骨质疏松模型一样,大鼠不发生骨量减少引起的脆性骨折。这种缺陷可以通过分析椎体、股骨干和股骨近端等部位骨的力学特性来弥补。对12月龄去卵巢大鼠进行雌激素补充治疗可以保持椎体的骨强度,这与临床应用雌激素可减少老年妇女骨折发生的情况一样。用大鼠椎体及四肢骨代替人骨,通过强度分析,能够评价那些预防骨质疏松及骨折的药物的作用效果。Giavaresi等对大鼠的第5和第6腰椎的BMD、生物力学(压力实验)及组织形态学分析,发现第5腰椎BMD最大抗压、弹性模量和形态学参数,去卵巢组比假手术组有显著下降,logistic回归分析显示双能X线和定量超声能很好地识别假手术大鼠和去卵巢大鼠;通过DXA的BMD与骨的生物力学相关,定量骨超声测量的骨松质的微结构改变与组织形态学相关。

雄性大鼠去睾丸后也出现骨丢失,主要原因为雄激素不足造成蛋白质合成减少,导致骨胶原合成降低,表现为骨的有机质丢失。雄性SD大鼠研究年龄相关的骨丢失,最好从12月龄开始。

小鼠是研究基因功能/峰值骨量/增龄性骨丢失的主要动物

不同种的小鼠,有其各自不同的峰值骨量,应用连续显性的杂交实验可以指导观察其遗传学特性。最近的研究证实C57B1/6J小鼠PBM低,而C3H/HeJ小鼠的PBM高;SAM/ P6是一种衰老加速的小鼠,有低的峰值骨量和中、老年时易发生骨折的倾向。它是仅有的一种能证明增龄性脆性骨折的实验动物。由于它存在遗传性骨胶原缺陷,当研究用雌激素和二膦酸盐治疗时,难以发现导致低峰值骨量的主要因素。近年来,应用现代分子生物学技术,如杂交技术和cDNA探针等,对特定的基因位点进行识别分析,通过完整的基因学研究,识别1个或多个与骨质疏松相关的遗传基因,这些基因与骨量的高低有关。这些新的发现,将增加PBM基因控制因素方面的资料,为大动物和人类的研究提供有益经验。此外,转基因技术的发展更进一步增加了这种模型的应用。少数研究将小鼠作为研究人骨质疏松破骨细胞、基质细胞的演变与发育的模型,也取得成功。雌性小鼠被切除卵巢后,其骨量变化与大鼠相似,雌激素缺乏的骨丢失可由雌激素补充疗法所预防。小鼠模型的缺点在于可供研究用的血清少,发情期不受下丘脑-垂体轴调节等因素的影响。

狗主要用于失用性骨质疏松造模

在品种的选择上,一般选用目的杂交系(purpose bred)的小猎犬,而随意杂交系(random bred)因为不知其背景,不适于骨代谢研究。

狗具有以下优势:

  1. 在合成代谢和结构特征方面,成年狗与人类骨骼相似,其皮质骨与松质骨的比例与人骨相当;
  2. 哈佛单位和松质骨重建与人相似,在评价合成代谢药物对松质骨和哈佛管重建的影响时是优秀的模型,但狗的重建更快;
  3. 体内钙、磷代谢已有文献资料可查;
  4. 实验操作相对容易,可在狗的髂骨上做多次骨活检,便于反复、长期观察;
  5. 费用较灵长类低;
  6. 是杂食动物,胃肠系统与人类相似。

其不足之处是:

  1. 狗每年仅排卵两次(春、秋季),与人类生殖生理学相差甚远;
  2. 动情高峰出现前,其性激素水平保持不变;
  3. 卵巢及子宫切除并不能诱发相当明显的骨丢失,而且狗对卵巢功能丧失的组织学反应不均一。

在成人骨骼的猎犬模型中,卵巢切除模型是有争议的。首先,卵巢切除后的猎犬有一个早期的骨形成活跃期,这就提示,去卵巢猎犬在对雌激素缺乏的骨反应机制上与绝经期女性可能有明显的不同;其次,狗的骨组织生长代谢对雌激素的依赖性相对较小,其卵巢功能停止后,并不像人类一样易致骨质疏松。Shen等认为,切除卵巢和子宫的猎狗并不发生组织形态学、骨量和生化参数的改变,然而有研究表明,猎犬卵巢切除后,因雌激素缺乏引起的骨丢失可能每年在8%~10%左右。但不管怎样,狗去势后骨组织学反应个体间差异大;缺乏骨组织形态和数量上的反应、缺少骨量和生化指标的改变,限制了狗在绝经后骨松质丢失研究中的应用。去睾丸狗可作为人类低促性腺激素或低性激素导致骨质疏松的模型。

目前比较肯定的是,应用狗研究失用性骨质疏松较为成功。通过对狗长期非创伤性制动后骨丢失过程的观察,发现狗长期制动而引起的骨丢失速度和总量很大程度上取决于年龄。可能是由于骨质更新率减慢,老年狗对失用的反应较年轻成年狗轻,骨丢失较少,骨内膜表面新骨平均形成率低,丢失部位主要在近骨内膜区,而年轻成年狗骨丢失主要发生在骨外膜区。两个年龄组都是骨松质的骨丢失多于皮质骨,但年轻成年狗发生骨丢失时间更早。在有肌肉附着的皮质骨部位,骨丢失的速度更快。

猪用于研究氟化物和运动对骨骼的影响

常用的为小型猪(minipig),成年猪体重很少超过60kg。农家猪因为体积太大,管理和饲养困难,不适于医学研究。小型猪有不同品种如Sinclair、Hanford、Hormel和中国的贵州小型猪等。小型猪作为骨质疏松模型有如下优点:

  1. 有恒定的发情周期,与人类相似,每次18~21天;
  2. 有板层骨和骨小梁结构,皮质骨重建和松质骨丢失与沉积的发生率,与人类相似;
  3. 骨骼大,足以接受人工装置的植入,可以重复多次进行骨组织活检,多次取血标本;
  4. 胃肠道解剖特点、杂食性饮食均与人类相似。

不足之处:

  1. 所需费用较高;
  2. 卵巢、子宫切除手术比狗更困难,因为子宫的血管更容易破裂;
  3. 负重方式与人类不同;
  4. 同人类相比有较高的骨量及更为致密的小梁骨网状结构。

Ikeda等用泼尼松龙0.5mg/(kg·d),每周5天,连续26周皮下注射8月龄Gottingen小型猪,发现糖皮质激素能同时减少骨形成和骨吸收,抑制生长期小猪年龄相关的骨量增长,降低其结构性能和力学特性,较好地模拟人糖皮质激素诱导的骨质疏松状态。Borah等取18月龄Sinclair小型猪去除卵巢连续观察18个月,OVX小型猪骨量、骨结构参数、骨强度均显著下降,符合绝经后骨代谢改变。

羊作为模型使用尚存在需要解决的问题

包括绵羊和山羊。绵羊是一种极具潜力的骨质疏松模型动物,近年来已越来越多地运用于骨质疏松研究。绵羊作为动物模型有许多优点:

  1. 性情温顺;
  2. 易于饲养、管理;
  3. 相对便宜,能大量购买到;
  4. 有自发性排卵;
  5. 与女性相似的激素分泌规律;
  6. 体积较大,允许反复采取血、尿标本及骨组织活检;
  7. 绵羊的髂嵴与人的髂嵴有相似性;
  8. 便于安装人工植入体;
  9. 母羊用于研究氟化物对骨骼的影响,在骨沉积和对骨细胞的毒性反应方面与人类骨骼相类似。

年轻绵羊(小于3~4岁)的皮质骨是丛状骨,老年绵羊(7~9岁)可见到哈佛系统的重建,重建发生于股骨的尾部、肱骨和桡骨的骨干部分。用放射免疫法测定骨钙素,发现7岁绵羊血清骨钙素水平增高,与65岁老年妇女相似。有学者将7~9岁雌性绵羊双侧卵巢切除观察骨组织变化,发现手术后6个月髂骨骨小梁容量(BV/TV,%)、骨小梁厚度明显下降,低于手术前,并出现选择性小梁骨骨丢失;而骨小梁间距则明显高于手术前。

绵羊作为骨质疏松模型的不足之处包括:

  1. 维生素代谢和矿物质需要量与人相差较大,磷代谢与人相差亦大,尿磷排泄较人低,消化道是绵羊磷排泄的主要渠道;
  2. 无自然绝经;
  3. 通常动情期只出现在秋、冬两季;
  4. 消化系统与人类有差异,为反刍类动物,如要进行口服药物实验,需建立胃瘘管。

此外,绵羊作为骨质疏松的大动物模型,尚存在不少需要解决的问题:

  1. 需搞清楚股骨的哪个部位骨重建最活跃。
  2. BMD、生化指标、髂嵴的组织形态学等指标有季节性和生物节律性波动;此外,经产、妊娠、子代的数量和哺育也能影响这些指标。
  3. 如何排除外界因素引起的骨丢失,这些因素包括繁殖、食物(钙磷比值)、接受阳光的程度等。
  4. 在1年的哪个季节进行卵巢切除手术引起骨丢失最迅速。
  5. 目前尚不知其峰值骨量年龄。

Siu等应用μCT和pQCT评价山羊去卵巢模型。发现山羊去卵巢手术后6个月BMD下降16.3%,BV/TV下降8.34%,Tb.N下降8.51%,骨小梁连接密度下降18.52%,骨强度降低,符合骨质疏松的典型改变。

其他动物模型应用较少

猫(cat)

猫在生长过程中,通过固定、低钙饮食或高磷饮食均可诱发骨质丢失,加上猫易于实验操作、饲养管理,显现出猫用于骨质疏松研究的可能。但猫具有季节性周期、体内激素水平变化平缓以及雌猫去卵巢后骨量丢失不明显的特点,限制了猫在骨质疏松研究中的广泛运用。

兔(rabbit)

自然寿命一般为8~10年,性成熟4~5月龄,性周期8~15天,繁殖率高,容易饲养,抗空气感染力很强,是很有前途的实验动物。其骨转化较灵长类快,且在性成熟后不久(约6月龄)骺板闭合,与人类相似。成年兔有哈佛管重建活性,可以用于合成代谢促进药物对骨松质及哈佛管系统重建作用的研究,以及用于研究睾酮及雌激素对生长发育过程中BMD的影响,或作为糖皮质激素诱导的骨质疏松动物模型。在卵巢切除模型方面的研究较少,一般认为制作去势兔骨质疏松模型,以5~6月龄为宜,经过半年周期,骨质疏松模型基本可建立。此外,应用兔进行失用性骨质疏松的研究也有一些报道。

鸟(bird)

鸟类作为研究骨代谢的模型,具有方便而廉价的优点,随着鸟体内血清雌激素水平升高,雌鸟骨骼发生骨沉积,给予雌激素的雄鸟也发生骨沉积现象,鸟通常有一个小的皮质骨或哈佛管骨重建,但与雌激素相关性骨质疏松和骨软化表现却没有被发现。尽管鸟模型已被引入新的骨细胞起源与骨对机械刺激的反应研究,但它们并不是公认的研究雌激素缺乏的骨质疏松模型,因为它们的骨骼行为不能模仿成人骨质疏松的特性。

非人类灵长类动物(primate)

非人类灵长类动物模型为最适合的骨质疏松动物模型,与其他种属动物相比,具有以下优点:

  1. 很多灵长类身体保持直立位,它们的骨生物力学特性与人体极为相似;
  2. 所有灵长类动物都有一个规律的月经周期,部分灵长类动物有着与人类女性相似的周期性动情期及绝经,雌恒河猴的月经周期和激素形式接近于女人,非人类灵长类动物和人类在卵巢功能停止后骨反应相似;
  3. 在组织形态学方面,体内器官系统包括胃肠道系统、内分泌系统、骨代谢等与人类相当接近,存在制动性和增龄性骨丢失;
  4. 饮食要求亦较其他动物接近人类。

其不足之处在于:

  1. 由于灵长类动物均为野生,因而,不可避免地携带有动物源性传染病,例如Marburg病毒、Eloda病毒、病毒性肝炎(B病毒)及结核等,并且传播动物源性疾病的危险性相对较高;
  2. 所需费用昂贵;
  3. 饲养管理条件要求高,训练有素的技术人员才能制服攻击性很强的灵长类;
  4. 实验操作较危险,即使抽取少量的血标本或者常规健康检查也必须对动物进行麻醉;
  5. 实验周期长。

由于灵长类动物自然绝经时间在其自然寿命的第20~30年,且PBM出现的时间为9~11岁左右,所以灵长类动物模型通常用于观察长期的去卵巢状态对骨骼代谢的影响。雌性灵长类动物在去卵巢后呈现出如下特点:骨量较绝经前显著下降;骨量丢失模式、丢失幅度以及骨转化率增高与绝经后女性类似;绝大部分骨量丢失发生于术后第1年。动物年龄的选择是复制模型成功与否的关键。如果选择的动物过于年轻,在PBM达到之前即行卵巢切除术,则只会出现骨发育的停止,而非骨量的丢失,建立的去卵巢模型不适于绝经后骨质疏松的研究。

老年狒狒和恒河猴在脊椎病理上常发现有严重的骨性关节炎。狒狒的骨性关节炎带有明确的年龄相关性,发病的椎骨前缘高度下降,与脊椎压缩骨折很相似。由于骨性关节炎骨赘的存在,老年灵长类动物脊椎骨量测定常受影响。恒河猴前臂aBMD在达PBM后随年龄的增长而减低,雌性猕猴在达到10岁龄PBM以后,椎体骨骨量每年丢失3%~4%,出现类似于人的改变,提示非人灵长类动物在增龄性骨代谢研究中的应用前景。

由于灵长类动物与人类在进化树中的位置最近,对建立基因显性特征研究方面很有帮助。结合鼠类和灵长类的遗传研究,可以通过多种途径了解PBM的遗传控制因素,这对人类骨代谢及遗传控制因素的应用研究有重要意义。

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