转基因糖尿病动物模型

转基因动物模型是指以实验方法导入外源基因,在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物模型。有关T1DM、T2DM和MODY的转基因DM动物均有报道。

转基因动物模型用于研究病毒诱导的自身免疫性T1DM

转基因小鼠主要涉及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV、流行性感冒病毒蛋白和EB病毒等。其中最成功的转基因动物模型是在胰岛β细胞鼠胰岛素启动子(RIP)下的LCMV蛋白表达模型。这种转基因小鼠不发生DM,但小鼠在感染了LCMV后发展为DM。有两种RIP-LCMV转基因小鼠模型,其中一种转入的病毒基因只在胰岛β细胞表达,在感染了LCMV2周内迅速发生DM。而在另一个模型中,转入的病毒基因在胰岛细胞和胸腺均有表达,其中H-2d和H-2b小鼠分别在感染了LCMV后的2个月内和3~6个月才缓慢发生DM。CD4+T细胞在迅速起病的H-2d转基因小鼠不是必需的,但对缓慢起病的H-2b转基因小鼠的DM的进展却是必需的。LCMV特异性细胞毒性T淋巴细胞的数目与DM的起病方式相关。因为只诱导了极少的LCMV特异性细胞毒性T淋巴细胞,即使给转基因小鼠接种表达LCMV的病毒疫苗也不会导致DM,但是自身反应的细胞毒性T淋巴细胞可通过表达辅刺激分子B7.1或细胞因子TNF-α在β细胞局部增生,在接种表达LCMV的病毒疫苗后能诱发DM。

双转基因小鼠被用来研究各种细胞因子在T1DM发展过程中的作用,如同时表达LCMV蛋白和胰岛β细胞的一种细胞因子或细胞因子被敲除而在胰岛β细胞表达LCMV蛋白的小鼠。IFN-α在RIP-LCMV转基因小鼠的β细胞表达上能诱导在感染LCMV后自发性DM的发生,但IL-2在RIPLCMV转基因小鼠的β细胞表达后,尽管T1DM的起病时间明显提前,但是没有发生自发性T1DM。TGF-β或IL-10也没有改变RIP-LCMV转基因小鼠的DM发生率。在β细胞同时表达IL-12 和LCMV抗原的转基因小鼠不自发DM,但是感染LCMV后发生T1DM的速度加快。早期在β细胞表达TNF-α能提高DM的发病率,但晚期表达TNF-α后自身免疫过程却消失了,提示TNF-α在自身免疫DM的发展过程中发挥了双重作用。

最近有证据表明,抗原呈递细胞在RIP-LCMV转基因小鼠T1DM的发展过程中发挥了重要作用。在这些小鼠感染LCMV后不久,活化的巨噬细胞就浸润胰岛。LCMV特异细胞毒性T淋巴细胞的激活是通过树突状细胞表达LCMV活化产物的优势免疫表位gp33,从而扩大β细胞特异的细胞毒性T淋巴细胞,加速了胰岛β细胞的破坏。免疫治疗的方法也已被用于RIP-LCMV转基因小鼠。口服猪胰岛素能阻止T1DM的发生,但是一个(AlaB30→Thr)或两个(FB25N,AB30T)氨基酸的替换就完全消除了胰岛素的这种保护作用。最近有研究表明给RIP-LCMV转基因小鼠接种编码因素B链的质粒DNA能通过诱导胰岛素反应性调控的CD4+T细胞从而阻止T1DM的发生。

除了上述两种病毒相关的转基因动物模型,人们还建立了在β细胞表达EB病毒受体CR2的转基因小鼠模型。其中具有H-2b(C57BL/6)H-2k(CBA)遗传背景的小鼠不发生DM。在β细胞表达CR2后将其移植到遗传上匹配的受体上,发现移植的胰岛β细胞出现了胰岛周围炎症。而且在胰岛周围炎症发生之前针对CR2的抗体就已经出现。上述研究提示T1DM的诱导发生可分为两个不同的阶段,首先是胰岛周围的炎症浸润和抗体反应,接下来包括胰岛细胞破坏的一些第二信号。

转基因T2DM模型的基因靶点很多

目前,转基因T2DM模型的基因靶点有胰岛素基因、PEPCK微基因、胰淀粉样多肽基因、鼠葡萄糖转运蛋白4基因和肥胖基因。

1. 转胰岛素基因动物模型:异源性胰岛素基因能在转基因小鼠的胰岛β细胞表达,而胰岛素反馈调节自身基因的表达。但是Marban等通过引入30拷贝的人胰岛素基因,造成了一定程度的高胰岛素血症(2~4倍)。

2. PEPCK高表达模型:Bosch等将多拷贝的PEPCK微基因导入小鼠,成功建立了持续PEPCK高表达模型,该小鼠逐步出现胰岛素抵抗和高血糖。

3. 胰淀粉样多肽转基因自发性糖尿病鼠:胰淀粉样多肽(IAPP)是T2DM的特征性病理改变,可能在2 型糖尿病的发病中起着重要作用。表达人IAPP基因的转基因自发性DM鼠有IAPP的过量产生和自发性胰岛病变的现象,表现为β细胞凋亡,胰岛缩小,电镜下有少量的IA原纤维,导致空腹血糖升高,肝源性胰岛素抵抗的发生,并最终引起肝外的胰岛素抵抗,高胰高血糖素血症和糖尿病。表达人IAPP基因的转基因鼠与一种肥胖和DM模型鼠——Avy/a鼠杂交,其杂合子鼠表现出胰岛素抵抗和高血糖。

表达人IAPP基因的转基因小鼠IAPP的浓度增加。表达人IAPP基因的转基因鼠较非转基因鼠DM的发病要明显增多,是人IAPP基因表达的结果。已有的研究表明,虽然在转基因胰岛细胞过表达的人IAPP会导致糖耐量受损,但是类似转基因小鼠中即使血中IAPP水平升高5倍,也未发现IAPP或高血糖。

4. 葡萄糖转运蛋白4过表达转基因小鼠:葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)过表达转基因小鼠研究表明,葡萄糖转运是肌肉葡萄糖储存速率的主要限制因素。转基因选择性在骨骼肌过表达的GLUT4导致全身葡萄糖摄取的增加,改善葡萄糖代谢。剔除GLUT4导致胰岛素耐量受损和骨骼肌及脂肪组织葡萄糖代谢障碍。

5. 胰岛素受体底物1(IRS-1) 基因敲除小鼠:IRS-1基因敲除小鼠无高血糖,只有轻微的体内胰岛素敏感性下降。

6. 转基因肥胖动物模型:人们通过两种新的转基因方法获得新的啮齿类动物肥胖模型。第一个是用神经微丝启动子将反义糖皮质激素受体(GCR)转录本表达。这种方法导致中枢神经系统中GCR表达下降,且伴随血中糖皮质激素升高。外周糖皮质激素升高或脑GCR表达下降的直接效应可能导致能量消耗下降,因此这些小鼠会出现肥胖。通过棕色脂肪组织(BAT)特异性线粒体解耦联蛋白CUCP基因启动子表达白喉毒性基因来剔除棕色脂肪组织,从而建立了另一种啮齿类动物的肥胖模型,是深入研究肥胖和T2DM相互关系的较好模型。毒性基因剔除方法也被用于建立脂肪营养不良模型,主要通过脂肪细胞P2启动子-增强子将白喉毒素表达于脂肪组织(白色和棕色脂肪)。GPDH通常表达于棕色脂肪细胞和其他组织,转基因过表达GPDH的研究表明通过无效循环在能量消耗中发挥重要作用。这种小鼠出现与白色脂肪组织数量减少相关的BAT肥大。

7. 其他糖尿病模型:单独的可溶性胰岛素受体外功能区被高表达后,这些小鼠血循环中有胰岛素结合活性,可导致慢性高血糖。

葡萄糖激酶基因和己糖激酶基因突变导致青少年发病的成人型糖尿病

将一种酵母的己糖激酶基因在转基因胰岛β细胞过表达可导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌,保护胰岛β细胞不对低糖刺激脱敏。Efrat等通过表达葡萄糖激酶带核酶活性的反义mRNA序列使胰岛葡萄糖激酶的表达被抑制70%,胰岛β细胞对葡萄糖的敏感性下降。(刘玮)

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