胰岛移植物排斥的防治

目前,尚无监测胰岛移植排斥的早期标志,血清C肽降低提示胰岛损害已不可逆转,故成人胰岛移植需长期应用强力的免疫抑制剂治疗以期防止排斥,这不仅增加感染与肿瘤发生率,且有肾和β细胞毒性。早期常用的免疫抑制剂为糖皮质激素、环孢素A(CsA)和他克莫司(FK506)均可诱导糖尿病发生。近年来国外致力于研究开发供体特异耐受性,可能避免受体长期应用免疫抑制剂。

可以通过特定基因敲除动物模型等方法抑制异种移植的超急性免疫排斥反应,例如α(1,3)半乳糖或补体结合成分基因敲除或补体抑制、补体消耗、血浆置换等方法去除抗体。急性排斥反应主要通过免疫抑制剂解决,而慢性排斥反应则通过免疫耐受方法解决。免疫抑制剂联合免疫耐受诱导是目前解决胰岛移植排斥的主要策略。近期研究进展主要集中在三方面:阻断T细胞识别抗原或抗原呈递细胞MHC复合物形成;阻断协同刺激促进针对抗原刺激的T细胞增殖反应;目标克隆激活或剔除达到抑制移植排斥目的。

免疫抑制剂的应用和进展

全身免疫抑制剂使用是预防移植物排斥的经典方案。第一代药物包括硫唑嘌呤、糖皮质激素、抗淋巴细胞血清。硫唑嘌呤是钙调磷蛋白磷酸酶抑制剂。钙调磷蛋白磷酸酶是细胞内钙依赖性丝氨酸-苏氨酸磷酸酶蛋白,负责细胞内调节蛋白去磷酸化,然后进入细胞核发挥转录因子作用。钙调磷蛋白磷酸酶抑制剂可以抑制细胞因子包括IL-2和其他对T细胞激活起重要作用的基因产物。尽管有效,但毒性很大,3/4的患者会出现肾毒性。副作用还包括高血压、肝毒性、神经毒性、多毛症、齿龈增生和胃肠道反应。其他常用的免疫抑制剂如糖皮质激素,通过阻断T细胞增殖和细胞因子基因表达发挥作用,可进一步阻断IL-2合成,具有非特异性抗炎和抗黏附功能。长期使用的副作用包括溃疡、血糖升高、骨质疏松、并增加感染和肿瘤的可能性。抗淋巴细胞血清通过多克隆抗胸腺细胞球蛋白,减少受体T细胞发挥作用。

胡远峰等报道泼尼松能明显延长大鼠中胰岛异体移植物存活,与硫唑嘌呤联用并未能加强抗排斥作用,却更易并发严重感染。抗淋巴细胞球蛋白是较有效的抗排斥制剂,可使胰岛异体移植物存活显著延长。Lacy等将大鼠胰岛24℃培养7日,移植前给受体注射1次抗淋巴细胞血清,使异体移植物的存活显著延长。

第二代药物包括环孢素A和他克莫司等,多联合用药又称鸡尾酒疗法。环孢素A作用于T淋巴细胞和胞内受体蛋白形成异二聚体。环孢素A (CsA)是应用最广泛的免疫抑制剂,在治疗期间可使移植物保持存活,但停药后可发生排斥,它有肾毒性,对胰岛细胞亦有损害作用。他克莫司(FK506)是一种新的免疫抑制剂,已在许多动物模型中证明有抑制异体移植物排斥的作用。他克莫司和T淋巴细胞内另一种胞质蛋白结合,在体内测定FK506的机制中提示用该药阻断T细胞活性时的浓度只及环孢素A的1%。据Hulle等报告,任何浓度FK506对人胎胰组织均无毒性,然而Lohmann观察发现32例用FK506治疗的肝移植患者,经1~3年随访,9例发生糖尿病,5例伴有ICA阳性,而CsA治疗的患者未发生糖尿病和ICA阳性,表明用FK506的免疫抑制治疗对抑制胰岛细胞的自身免疫可能无益,甚至可诱发糖尿病。

环孢素A、他克莫司和类固醇等免疫抑制剂均存在胰岛毒性,致糖尿病副作用。无胰岛毒性的新型免疫抑制剂成为研究热点。最近,在小鼠模型的研究显示辛伐他汀(舒降之)可减少抑制部位的非特异性炎症反应,并可防止早期的胰岛异体移植物功能丧失。其他相关的新型免疫抑制剂,如麦考酚吗乙酯(骁悉,MMF)及西罗莫司(rapamycin)能防止排斥,似不导致胰岛毒性,逐渐成为临床胰岛移植的常用免疫抑制药物。

随着免疫学研究进展,一些新型免疫抑制剂不断问世。T细胞活化的重要步骤包括APC持续表达CD40与T细胞间断表达CD40配体或CD154结合。CD154与CD40的相互作用在移植物排斥中发挥重要作用。通过CD154单抗可以阻断该协同激活过程。Kenyon在接受胰岛移植的狒狒应用抗人CD154单抗(hu5c8),以观察对移植物存活的影响,未用免疫抑制治疗及用FK506治疗的动物,胰岛移植无效,而在移植前1天、移植后第3天及第10天分别给予hu5c8(20mg/kg)的7例模型,移植物功能存活明显延长,最长达264天,表明抗人CD154单抗可明显保护胰岛移植物功能。

CD3分子存在于所有T淋巴细胞表面,接近T细胞受体抗原识别复合物区域。抗CD3抗体(OKT3)可以有效阻断免疫抗原诱导的T细胞活化。1995年人抗CD3单抗问世,通过FC区域基因突变而缺乏FC受体结合活性。抗CD3单抗——莫罗单抗已成为目前器官移植治疗急性排斥反应的经典药物,与T细胞结合阻止参与免疫反应,并引起外周血中T细胞数目急剧下降。在啮齿类和灵长类动物及人试验中均证实胰岛移植中莫罗单抗可以导致T细胞对免疫刺激无反应应答。灵长类动物糖尿病模型研究发现联合使用抗CD3单抗、环孢素A、甲泼尼龙四天,胰岛移植受体均获得移植后18个月的正常血糖控制。2004年无FC受体结合能力的人抗CD3单抗hOKT3γ1(Ala-Ala)联合西罗莫司和他克莫司用于治疗胰岛移植糖尿病患者,6例患者中4例血糖恢复正常,长期随访CD4淋巴细胞减少,CD4/CD8比例倒置。

细胞黏附分子白细胞功能抗原1(LFA-1)和其配体ICAM,参与淋巴细胞运输、游走、炎症反应激活、免疫排斥。移植组织破坏过程中二者的主要作用是非特异性黏附T细胞,刺激T细胞浸润,与移植物作用导致排斥发生。Nicolls等研究显示白细胞功能抗原1单抗可以延长不同窝大鼠间异体胰岛移植存活。预先用白细胞功能抗原1单抗处理6天的胰岛植于链佐星致糖尿病鼠肾包膜下,对照组以IgG处理,处理组获得正常血糖控制而对照组高血糖未得到改善。以白细胞功能抗原1配体ICAM-1为目标的单抗同样可以预防免疫排斥。体外用ICAM-1单抗预处理人胰岛细胞可以延长人鼠异种移植移植物存活,淋巴细胞浸润明显减少,移植物存活延长,不伴有免疫耐受,提示ICAM-1单抗阻断的局部作用。

改变移植物的免疫原性

供体组织预处理或移植前经体外培养,可以去除供体过路白细胞,降低移植物的免疫原性。供体胰岛在体外低温(24℃)培养1周,移植时注射1次抗淋巴细胞血清,或巨大胰岛在体外高氧(95%)培养,可使异体与异种胰岛移植成功。徐静娟等报道,新生猪胰岛制备物经24℃培养、冷冻保存、激光照射等体外预处理后,其胰岛淋巴细胞混合培养(MILCs)的cpm值,胰岛内DR阳性细胞数与淋巴样细胞数比未预处理对照组明显降低,提示上述预处理可明显降低胰岛制备物的免疫原性。胡远峰等报道了37℃或24℃培养与冷冻保存预处理对人胎胰岛免疫原性的影响,经MILC显示各种预处理后,人胎胰岛的刺激指数、人胎胰岛组织内DR阳性细胞数与LCA阳性细胞(主要为淋巴样细胞)数均比未预处理者显著减少(P<0. 001)。Rabinovitch等报告,组织培养可使大鼠胰岛中带Ⅰa抗原的淋巴细胞、巨噬细胞与毛细血管内皮细胞减少,这可能与经培养的胰岛移植物免疫原性减少有关。小鼠胰岛用特异性抗Ⅰa血清与补体预处理可使异体移植物长期存活,分离纯净的胰岛细胞提供移植亦是减低移植物致免疫性的一种合理方法。已分离的胰岛经紫外线照射可使胰岛的致免疫性减低,而不影响胰岛功能。在胰岛组织培养液中加入抗树突状细胞单克隆抗体处理后,可使异体移植物存活明显延长。

最近,董维平等通过体外MHC-Ⅱ单抗预处理及24℃培养成人胰岛细胞,可显著降低成人胰岛移植物的免疫原性,表现为胰岛-淋巴细胞混合培养(MILC)刺激指数较降低、HLA-DR和LCA阳性细胞较对照组明显降低。但预处理组胰岛素释放试验的刺激指数、3H-亮氨酸掺入指数和凋亡细胞数均无显著性差异,提示抗人MHC-Ⅱ单抗和24℃培养能减少成人胰岛移植物中免疫原性,但对胰岛功能无明显影响。

免疫隔离

通过选择性半透膜将胰岛与受体的免疫系统隔离,葡萄糖和胰岛素可以双向弥散,大分子量物质,如抗体或细胞不能通过。这种保护胰岛的物理性屏障包括微包囊等多种免疫隔离装置。由加拿大籍华人孙绵方等开发,将胰岛混悬于海藻酸盐微滴中,其外面包被一层聚赖氨酸。这种微包囊的主要问题是其稳定性与生物相容性,之后在其外再加一层海藻酸盐,使其生物相容性增高(即APA生物微胶囊)。孙绵方等采用高压静电微囊成型仪生产的微包囊,大多包含1个250~350μm直径的胰岛,异种移植于自发性糖尿病猴,15天后血糖恢复正常,停用胰岛素治疗已800多天。此外,中空纤维微囊由丙烯酸共聚物构成,其里面含渗透选择性膜,存在问题是胰岛聚集成团,导致中心坏死,短期内丧失功能。通过海藻酸盐包被胰岛,再放入中空纤维内,可避免上述现象发生。据报道将含500个大鼠胰岛的中空纤维植入糖尿病小鼠皮下,血糖恢复正常60天后,取出含胰岛的包囊,切片染色显示β细胞分泌颗粒良好,在囊外面仅有一薄层胶原,表明其生物相容性尚好。近年来这方面研究虽有较大的进展,但限制其临床应用的阻碍依然存在:对用于免疫隔离胰岛物质的纤维化反应,使半透膜变为不透膜,导致囊内胰岛失活;小分子量分子如移植部位免疫细胞激活而释放的小分子的致炎因子(IL-1,NO等)仍能通过保护性半透膜损害包囊内的胰岛;此外微囊亦影响了移植胰岛的再血管化。故其生物相容性与稳定性尚需研究改进。

免疫耐受诱导

早期观察到孪生动物由于在胎儿期共用母体胎盘循环,所以移植后不需要免疫抑制剂。这种移植耐受被归因于动物新生儿期间暴露于异体抗原。这种免疫系统选择性地免疫接受异体移植物被称为免疫耐受。耐受被定义为对免疫刺激特异性无免疫反应。临床和实验室常用于判断免疫耐受干预成功的标准是无需免疫抑制而获得长久的移植物存活。研究表明组织学证据证明无慢性免疫排斥反应,对于判断免疫耐受干预成功也很必要。在免疫系统发育的不同阶段均可获得异体或异种移植的免疫耐受。干预方法以移植物、供体、受体为目标。根据干预机制,可分为移植免疫活性调节、去除过路白细胞、诱导移植物耐受几种。

异体移植排斥主要由T淋巴细胞介导。T细胞在胸腺成熟后释放入血,并通过阳性和阴性选择识别自身和非自身抗原。在移植前将异体抗原直接注入胸腺,受体T细胞对胸腺外的异体胰岛移植产生免疫耐受,这种选择性移植物耐受的建立是很有前景的方法。近亲交配的啮齿类动物在出生后不久即予注射供体种属骨髓诱导免疫耐受,可使胰岛异体移植物长期存活。在成年动物中诱导特异性免疫无反应性则较困难。据报道,在预先应用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的受体胸腺内植入供体细胞或抗原可以诱导供体特异性免疫耐受。Nazi等已证明可使啮齿动物异体移植物存活无限期延长,由于胸腺随年龄增长而萎缩,技术上难以准确地将供体细胞或抗原植入完整的胸腺组织内,因而,此方法临床应用的可能性尚有争议。由于异种移植排斥体液免疫占主导,所以该方法仅适用于同种异体移植,对于异种移植无效。研究发现小鼠同种异体间胰岛移植可以通过胸腺注射诱导免疫耐受延长存活,而小鼠与大鼠间异种移植胸腺内胰岛注射没有达到延长存活期的目的。

供体特异性移植免疫耐受可以通过模拟中心耐受(胸腺耐受)达到,导致受体接近完全且持续的供体特异性T细胞克隆消失。通过供体与受体混合多谱系造血嵌合体(multi-lineage haematopoietic chimaeras)动物模型成功获得长期的受体和供体特异性T细胞克隆消失。将供体骨髓或造血干细胞植入准备器官移植的受体建立嵌合体,受体外周免疫系统的供体特异性T细胞被破坏,同时抑制胸腺T细胞迁出。动物模型基础研究中,获得供体造血细胞移植成功要求免疫抑制,但在造血嵌合体同种异体移植不需要免疫抑制治疗获得免疫耐受。该方法的最大优点是在恢复和保存其他免疫反应的同时得到免疫耐受。近年研究证明,给受体小鼠多次输注供体骨髓细胞能达到嵌合(chimerism),通过供体骨髓细胞输注和免疫抑制剂FK506短暂应用后能达到对大鼠胰岛受体的耐受。临床上,对已停用免疫抑制治疗的长期人移植物受体的耐受已获得微嵌合(micro chimerism)的证据,故认为嵌合的建立对供体特异耐受性的诱导与维护可能是一种先决条件。受体组织分析显示有供体衍生的树突状细胞(DCs)存在,因DCs是体内最强力的APC,且早已被认为与排斥反应的直接激发有关,故认为不成熟的亲代DCs对耐受产生过程(toleragenic process)是重要的。根据供体骨髓细胞输注可能增加嵌合产生的机会这种概念,在异体移植物包括人胰岛受体中验证此学说的临床研究正在进行,如证明可能建立免疫嵌合,诱导一种供体特异性耐受状态,而中止或明显减低长期免疫抑制治疗的剂量,那将对胰岛移植有深远的意义。

T淋巴细胞需要T细胞受体和一系列复合受体作用提供一些辅助和协同刺激信号,达到完全激活。如果阻断这些复合受体和协同刺激途径可以导致激活不全和免疫耐受。CD45是跨膜酪氨酸磷酸酶家族,与T细胞受体介导信号转导有关,CD45单抗可以阻断T细胞活化的协同激活过程。研究发现CD45单抗(huPBL)注射可以延长NODSCID小鼠异体胰岛移植存活。其他研究发现CD45单抗延长糖尿病小鼠模型肾包膜下异体胰岛移植物存活。细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA4)是T细胞下调分子,与外周免疫耐受发育相关。CTLA4与免疫球蛋白(IgG)Fc域融合可延长半衰期。研究发现通过注射CTLA4-Ig诱导人小鼠异种胰岛移植免疫耐受,推测CTLA4-Ig阻断小鼠对人胰岛细胞的免疫排斥,是通过直接影响T细胞识别抗原呈递细胞的B7分子,CTLA4-Ig融合蛋白通过与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2分子竞争结合,干扰CD28或CTLA4介导协同刺激,抑制T细胞激活和抑制细胞免疫反应。

细胞因子参与胰岛移植排斥损伤和免疫调节作用。IL-1,TNF-α,IFN-γ等直接作用或激活参与移植物损伤,IL-4、IL-10、TGF-β等干扰移植物排斥。基础研究发现腺病毒转染胰岛细胞IL-1受体拮抗剂可以阻止IL-1诱导的胰岛损伤和功能丧失,IL-1受体拮抗剂不仅可以预防胰岛移植物损伤,而且可以预防胰岛炎发生和糖尿病发病。

由于免疫学进展,胰岛移植免疫抑制和耐受研究发展很快。尽管这些从不同层面、不同机制作用于免疫系统的多个方法是很有前景的,但单个方法的效果有限,所以多种方法联合。目前,尚无监测胰岛移植排斥的早期标志,移植物存活时间和功能常作为治疗终点,免疫细胞浸润用于直接评价T细胞反应。

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