泌乳素瘤和垂体瘤动物模型

自发性和移植诱发的动物模型是泌乳素瘤模型

Wistar/Furth/Ico系鼠中有自发性垂体瘤。泌乳素瘤常有出血,细胞常排列为片状,血清抗鼠泌乳素抗体大多为阳性,少数有多个核,粗面内质网发育良好,海绵状细胞排列呈束状,胞质内有少量空泡。其形态学特点、良性过程、泌乳素分泌等特点与人泌乳素瘤类似。将雌性Wistar/Furth鼠的自发性泌乳素瘤切除后移植到同种雌鼠肾被膜和皮下。受体为2~10月龄,没有用雌激素治疗,被移植的肿瘤称为SMtTW1 和 SMtTW2瘤。研究连续15代,肾被膜下移植的成功率为100%,皮肤的成功率为20%。放免检测泌乳素、生长激素和肾上腺皮质激素。免疫细胞化学的结果显示肿瘤仅分泌泌乳素。移植后3~5个月可发现泌乳素瘤。肿瘤为良性,生长缓慢,SMtTW2瘤的泌乳素分泌和生长能被溴隐亭抑制。该肿瘤对研究生长因子有很好的价值。

F344鼠为雌激素诱导肿瘤的最敏感小鼠,是研究泌乳素瘤的很好动物模型。另外,每4周给Wistar 雌鼠注射2.5~5mg长效雌激素,可诱发小鼠泌乳素瘤。

针对垂体激素和激素受体,经过遗传操作建立的转基因(transgenic,TG)、基因敲除(knockout,KO)及基因植入(knockin,KI)为激素和相关组织的内分泌功能研究提供了良好的动物模型。

泌乳素瘤转基因动物模型过度表达TGF-α

将大鼠的泌乳素启动子与转化生长因子-α(TGF-α)结构基因相融合,构建了垂体泌乳素细胞过度表达TGF-α的转基因模型,其雌激素诱导的泌乳素细胞增生与大鼠垂体的TGF-α增加相关。

转基因垂体瘤模型研究致瘤病因

垂体瘤模型

小鼠过度表达hGHRH形成垂体瘤。转基因鼠糖蛋白激素a亚单位(aSU)启动子与SV40的T抗原编码序列融合后形成产生aSU瘤,肿瘤局部有bLH和bTSH的免疫反应,aSU与神经组织混合在一起。推测肿瘤细胞分泌亲神经因子,转基因鼠在人β-actin启动子的控制下表达人乳头状瘤病毒肿瘤基因形成了神经上皮细胞新生物,其中包括垂体瘤。其他动物模型有MEN1基因敲除、Carney复合症基因(CNC)敲除等。

用1109bp的hTSH基因5′读码框序列与SV40 T抗原融合形成转基因鼠,杂合子后代为侏儒症,7周后可见头部肿瘤。小鼠开始消瘦并3周内死亡。垂体肿瘤由小而不染色细胞组成,少数为多形核巨细胞,GH、PRL、促甲状腺激素(TSH)及黄体生成素(LH)免疫细胞化学染色阴性。肿瘤细胞核及T抗原染色强。

垂体增生和巨人症转基因动物模型

最早报道的巨人症鼠是由于过度表达异种GH或生长激素释放激素(GHRH)基因所致。转基因鼠的GH结构序列基因在看家基因启动子的控制下,许多器官都产生GH,导致血清GH上升和巨人症。金属硫蛋白-人GHRH(hGHRH)转基因鼠表达人GHRH基因,表达的组织包括垂体、胰腺、下丘脑的弓状核,循环中hGHRH升高,过量的hGHRH导致生长激素细胞功能显著增加,垂体分泌GH增加,伴IGF-1分泌增多,刺激垂体生长激素细胞导致增生和腺瘤形成。这些小鼠对慢性GHRH刺激反应的许多特点与观察到的肢端肥大症患者相类似,都来源于垂体,有胰腺或其他肿瘤的异位GHRH表达。将小鼠的MT-1启动子序列与人GHR基因编码区相融合后插入小鼠,小鼠可以过度表达人GHR,血GH增高,垂体重量增加。组织和免疫细胞化学检测显示,GH和GH-PRL免疫反应细胞大量增生。超微结构显示生长激素细胞扩大,粗面内质网和高尔基体丰富,分泌颗粒较多而大。

Burton等将霍乱毒素(cholera toxin,CT)基因插入大鼠GH和人类GH融合基因的5′末端翻译的位点,将形成的“rGH-CT”基因导入小鼠生殖细胞,建立了小鼠垂体增生和巨人症转基因动物模型,发现转基因小鼠的体重、垂体重量和血清GH均明显增加。他们认为,CT毒素转基因用于建立人类垂体GH瘤动物模型的机制可能是增加了细胞内的cAMP。Helseth等将连接在编码多瘤病毒大T抗原(the polyomavirus large T antigen,PyLT)cDNA上的多瘤早期启动基因微注射到小鼠受精卵的精原核,建立了小鼠Cushing病转基因动物模型。起初体重增加,13个月后出现的肿瘤约5mm。后来他们又把转基因小鼠的垂体腺瘤细胞移植到有免疫活性的非转基因小鼠,形成了与原代肿瘤在形态学核ACTH免疫反应性相类似的小鼠。

垂体特异性生长因子的定向表达亦可作为诱导肿瘤的模型。McAndrews等建立了转基因鼠过度表达转化生长因子A模型(TGF2A),后来该转基因鼠发生了泌乳素瘤。在另一个转基因模型内,以垂体为目标的神经生长因子的过度表达促使泌乳素细胞增生。

垂体腺癌模型

研究者从rb1敲除小鼠中发现了来源于垂体中叶的垂体腺癌。Pei等用免疫组化的方法未能在侵袭性腺瘤或垂体癌中检测到视网膜细胞瘤蛋白(PRB)的缺失。Bates等发现一小部分的肿瘤未能表达PRB,但是蛋白表达的缺失与rb1基因内标记的等位基因缺失无相关。Simp等发现27%的GH腺瘤和4%的无功能腺瘤未能表达PRB,这与rb1基因内标记的等位基因缺失也不相关。进一步研究提示,rb1基因启动子CpG末端的甲基化和基因与蛋白结合区的缺失是可能的机制。缺乏肿瘤抑制基因p27的转基因鼠出现多器官的肿瘤。P27蛋白的免疫组化分析显示,其最高浓度发现在非肿瘤的垂体中,在正常垂体向垂体腺瘤和癌的发展过程中,P27的表达明显下降。Carneiro等通过对鼠胚胎成纤维细胞的研究发现,p27缺失阻碍了Arf等依赖性细胞的凋亡通路。

条件基因敲除真实反映特定组织或细胞靶基因功能

条件性基因敲除法是在基因敲除基础上结合cre/LoxP系统,将靶基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段,从而可以真实反映特定组织或是细胞中靶基因被敲除或是修饰后的结果。它实际上是在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”,从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

基本原理

条件基因敲除的基本原理是利用一种位点特异性的重组酶cre。cre是一种主要存在于低等生物体中,但在哺乳动物细胞中能有效的发挥作用的重组酶。这个酶的特点是可特异性识别具有34个碱基的不对称的核酸序列loxP,使得两个位于loxP之间的序列发生重组。cre/ loxP系统首先是使目的基因位于两个同向的loxP位点之间,然后在ES细胞内发生同源重组,选择性标记筛选后,将其注入胚囊中,最后再注入假孕小鼠子宫内以繁殖转基因小鼠。这与传统的敲除技术一样,但是产生的小鼠却与正常小鼠表型一致,仅在基因组上目的基因的两端含有loxP位点。当cre出现时,loxP位点间的目的基因被敲除。因此这个系统需要不但需要目的基因位于loxP位点间的转基因小鼠,还需要cre转基因小鼠。将cre序列的前端插入组织特异性的启动子,就使得cre在特定的组织或细胞中表达,导致这些组织或细胞中的靶基因被敲除,而其他组织或细胞中cre不表达,靶基因不会被改变,也就形成不同组织特异性的cre转基因小鼠。因此,当目的基因位于loxP位点间的转基因小鼠与组织特异性的cre转基因小鼠交配后,则目的基因就可在特异的组织中敲除,达到了敲除组织类型上的控制。

条件基因敲除在下丘脑-垂体疾病中的应用

Sara等采用Cre/lox系统定向敲除GnRH神经元中的胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)后,敲除小鼠表现为青春期发育迟缓,给予IGF-1后仍不能逆转青春期发育迟缓。因此他们得出结论IGF-1R信号系统在协同GnRH调控青春期发育中起着重要的作用。Biondi等采用条件基因敲除技术特异性敲除垂体和内分泌胰腺的MEN-1基因导致小鼠在4月龄时发生胰岛素瘤,9月龄时出现泌乳素瘤。(袁凌青)