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异常血红蛋白的实验室诊断方法

电泳(eletrophoresis)

血红蛋白电泳是检测和鉴定异常血红蛋白最主要、最常用的实验室方法。由于该方法是按照电荷的多少来分离蛋白质,故其不能鉴别那些未引起电荷变化的氨基酸取代,特别是一些不稳定血红蛋白及氧亲和力增高的血红蛋白。

目前最简单最普遍的常规方法是应用醋酸纤维素膜,其可用于许多类型的电脉装置上。利用此方法可在30~120分钟完成血红蛋白电泳,将条带洗脱下来、分光光度计计数或扫描条带还可以进行定量。

用于筛选目的常规电泳条件为:碱性pH(8. 6~9. 1)下,Tris-EDTA-硼酸(TEB)缓冲液或用不连续缓冲系统(阴极为TEB,阳极为巴比妥缓冲液)。在上述条件下,通过与HbS标准物的泳动度比较异常Hb可分为五大组:Hbs J、A、F、S和C(下表)。如果更细致且加额外的标准物,则还可观察到异常Hb泳动度的进一步差异,但通常还不够确切,需要进一步分析才可识别阳性结果。

缓冲系统中加入6mol/L尿素及β-巯基乙醇可使α-链、β-链解离,而在电泳中分开。等电聚焦电泳(isoelectric focusing electrophoresis,IEF)有许多优点,其血红蛋白带可以精确定位,只用此一步便可得到上述四种电脉结合使用所获得的全部信息。而且可用此法进行大系列样品的筛查,其分辨率较高。但等电聚焦电泳目前还未广泛应用,这是因为某些试剂价格昂贵。

碱性pH下某些Hb在醋酸纤维素膜下的电泳泳动度

碱性pH下某些Hb在醋酸纤维素膜下的电泳泳动度

HbM可通过用氰化铁将所有Hb转化为高铁血红蛋白,然后进行pH的淀粉胶电泳而与HbA分开。

层析(chromatography)

用于分离Hb的层析柱主要是各种离子交换树脂,包括:DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素、CM-Sephadex、Amberlite IRC-50树脂。

高压液相层析(HPLC)的优点是快速,且仅需低于1mg的Hb。另外,它可以分离其他技术检测不到的变异物,可有效地分开HbA与HbF、HbH与HbI、HbC与HbO及HbE。

层析法亦可用于HbC存在下对HbA2进行定量。

放免分析(radio immunoassay)

免疫技术用于识别Hb变异物要比电泳、层析法更特异,但其需要应用抗体。已制备出40多种常用的变异物单特异性抗体。该方法的灵敏度可达到测定培养的红细胞祖细胞中血红蛋白的合成。

基于物理或化学性质改变的试验

一、HbS试验

HbS可通过其镰状特征进行检测,亦可测定Hb的溶解性。HbSD病可用溶解度差异试验来与镰状细胞贫血区别。测定HbS的溶解性实验中不稳定性血红蛋白可能产生假阳性。

二、HbF试验

在低水平下,HbF可通过碱变性试验定性。HbA在室温下暴露于标准KOH溶液(pH=12. 7)1分钟则变性,而HbF在此条件下则不变性。变性的Hb可经硫酸铵沉淀下来,溶液中的Hb则可通过分光光度测定计数。本试验可检测大于0. 5%的HbF,且准确度较高。Hb Bart及Hb Rainier亦可抗碱变性。

当HbF量大于15%时,可用醋酸纤维素膜上的碱性电泳进行定量。

HbF的细胞分布可利用差式染色技术进行测定。用柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=3. 2)冲洗固定的血液片,则HbA被洗脱下来,而HbF留在细胞中。如经上述处理后,用苏木精和伊红对片子染色,则含大量HbF的细胞被染成很深的颜色,而含少量或不含HbF的细胞不被染色。大多数血红蛋白病及地中海贫血中,发现有循环的HbF存在于单一细胞系中,因此经上述过程处理后,能够看到明显的两部分,深颜色部分的大小即为HbF所占比例的大小。

三、不稳定血红蛋白试验

热变性试验是一个有用的筛选试验,因为经常规电泳检测不到不稳定血红蛋白。将患者及正常对照的清晰的溶血产物与等量0. 1mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7. 4温育50℃,1~2小时,在不同时间间隔检测制备物中的沉淀,某些不稳定变异物可能需要较高的温度(高达65℃)。正常Hb保持溶液状态的时间更长些。沉淀是可通过分析保温前后上清液中Hb的量来确定。在保温过程中每隔5分钟取样进行测定则可更精确地计算出沉淀率。

另一个检测不稳定Hb的方法是异丙醇沉淀试验。取0. 2ml新鲜制备的溶血产物,加2ml含17%异丙醇的0. 1mol/L Tris-Cl缓冲液,pH 7. 4,37℃温育。含7种不稳定Hb(Christchurch、Sydney、Koln、Wien、Niteroi、Shepherds Bush及Southampton)的溶血产物5分钟时可观察到明显的混浊,20分钟可形成絮状沉淀。正常人200份溶血产物则40分钟仍未发现沉淀。含有HbH的溶血产物在10分钟时有少许混浊。沉淀物可用于进一步化学分析。

含有不稳定Hb的红细胞经体外活体染色(甲基紫或水晶紫)可证明包涵体的存在。这些称为Heinz小体的东西并非不稳定Hb病所特异,它们亦出现在G-6-PD缺陷及相关疾病中。一般而言,此试验的特异性及灵敏度均低于热变性及异丙醇变性试验。

杂交试验(hybridization)

杂交可用于测定含有取代氨基酸的异常Hb的多肽链。α-、β-链在低pH下解离后与同样的解离的犬Hb新组合。淀粉胶电泳分析上述产物,有4 种Hb-人犬及2种杂交型。异常链可通过杂交型Hb电泳带位置的改变来识别。

肽分析(peptide analysis)

首先将异常Hb分子破裂为小些的肽,通过此步用胰蛋白酶酶解。这些小肽有的仍不溶,除非在胰蛋白酶酶解前先进行硫-氨基乙基化作用,这样可使胰蛋白酶除可作用于赖氨酸残基、精氨酸残基外,还可作用于胱氨酸残基。

胰蛋白酶降解肽片逐个分离。可将混合物上样于滤纸上进行一相高压电泳及另一相层析,则每个肽位于滤纸上一个特定的位置,茚三酮染色,此称为“印迹”或肽谱。通过位置的改变可发现含有异常氨基酸的肽片。

现在大多数实验室进行结构分析是用自动层析柱分离肽片,异常肽片是通过其变化了的洗脱体积发现的。

单个肽片可从“印迹”洗下或柱子上收集,进行化学分析以测定氨基酸序列,一般用Edman降解法或自动测序仪。

肽分析及氨基酸序列技术只适用于具较好装备的实验室。一般只用于需要精确识别或检测一个新的变异物时。

珠蛋白合成速率测定

珠蛋白合成速率测定(measurement of globin synthesis)。珠蛋白合成速率的测定对于地中海贫血的定型很有用。含有网织红细胞的血液与一种放射性核素标记的氨基酸温育,一般用14C-亮氨酸或3H-亮氨酸,此时将标记放射性核素氨基酸在外生物合成珠蛋白,然后洗细胞,溶血,酸-丙酮提取珠蛋白。解离α-链及β-链,CM-纤维素层析(8M尿素)纯化,测定其生物合成速率特异活性。一般数值用β链活性与α链活性的比值来表示。正常Hb中β与α比值接近1。β地中海贫血的患者比值降低,α地中海贫血的患者比值升高。镰状细胞贫血、HbCC及HbSC患者此比值正常。因此试验可用于检测带有异常Hb的地中位海贫血。1984年中国医学科学院血液学研究所徐崇建立了此法,测定正常不同胎龄胎儿合成比值。并分析了β与α地中海贫血患者样品,结果三者有明显差别,同时比较了CAM电泳法与CMC层析法,证明CAM电泳法较简单,准确易推广,对地中海贫血或异常HbE-复合地中海贫血诊断及产前诊断均有意义。

PCR技术

目前用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)杂交和其他方法,可对地中海贫血,或异常Hb复合地中海贫血患者诊断及产前诊断,常用下列几种方法:

  1. PCR结合ASO探针斑点杂交技术。
  2. PCR结合限制性的内切酶图谱分析。
  3. 等位基因的PCR(allele specific PCR,As PCR),亦称3'碱基特异PCR

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