代谢平衡试验

代谢平衡试验(metabolic balance study)是研究体内物质代谢的一种重要方法,其目的是了解某种物质在体内的吸收、分布、排泄过程,探讨疾病的病因和病理生理特征。代谢平衡试验的适应证是:①研究糖、蛋白质、脂肪、电解质、矿物质和微量元素的代谢量与途径;②观察药物或毒物的吸收或代谢。但多汗、发热、腹泻、呕吐或伴有慢性消耗性疾病者不宜接受本试验。

在机体相对稳定的条件下,测定一定时间内某物质的摄入量和各种排泄物的排出量,以了解该物质的摄入和排出的平衡关系。如测定的摄入量小于排出值,则该物质有丢失,为负平衡(negative balance);如摄入量大于排出量,表明该物质在体内积存,属于正平衡(positive balance);如摄入值等于(或基本等于)排出值,为总平衡状态(total balance state)。但在实际工作中,由于实验方法、测定误差和个体差异等的影响与伪差,不能单凭一次实验结果作出结论。群体研究时,可用统计概率确定其意义。但由于代谢平衡试验的方法选择的对象有限,一般要同时做可比群体的对照观察。如为自身配对的试验前后对照研究,则个体差异较小。

以往用化学方法测定尿、粪及食物中的无机盐或氮含量,由于实验误差来源较多,在缺乏对照的条件下,主张以5%~10%作为实验误差基值。也就是说,摄入与排出的物质量在总摄入量的90%~95%范围内时,可视为总平衡,即总体水平上的平衡状态(balance state)。

近代的平衡试验多用稳定核素作标记示踪剂,由于误差减少,操作环节简化,总平衡的概念和定义应重新规定。

实验设计应注意对照/期限/膳食/标记物问题

实验计划和对照观察

一般可分为两类:①用A个体的结果同B个体进行比较;②同一个体在一种处理程序(包括饮食、药物、生活安排等)与另一种处理程序下的结果进行比较。因为个体差异性较大,故后一种方法的结果比较可靠。

实验期限

取决于研究内容。代谢平衡试验常以3~4天为一代谢期。代谢期太长,费时,且不利于观察对象的变化;代谢期太短,则粪便标本可能出现较大误差。如需要,留尿的间隔可以缩短,可分为24小时或48小时,亦可每8小时或12小时收集标本一次。

进食实验膳食数天后方可收集标本,这一时期称为过渡期(transitional period)或适应期(adaptation period)。其目的在于使机体在这一特定的条件下达到相对稳定状态。过渡期的长短可根据该物质在体内代谢的时间而定,一般为1~2天。同一受试对象在接受不同干预时,需有足够的间隔期。

实验膳食

根据研究目的和受试对象的饮食习惯,由营养师配制实验膳食。营养师首先要调查受试者自由饮食时的情况,然后制订食谱。要确保能量供应,并注意食物中其他相关物质的含量。试验前一天应进试验食,以及时调整食谱,确保试验期间受试者能完全摄入所规定的食物。如有剩余,应及时送至实验室检查,并从总摄入中减去。由于自来水和天然水中所含矿物质浓度较高,所以烹饪和饮用的水都需用蒸馏水或去离子水。

调查受试者的饮食习惯,根据研究目的制订食谱。试服实验膳食1天,调整食谱。进食实验膳食1~2天(过渡期)。每餐同时服用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)1g。在实验期第1天及实验结束后第1天早餐前,口服卡红(carmine)0.3g(装于胶囊内),或服药用炭(medicinal charcoal)0.5g。实验期每餐亦同时服用PEG 1g。

标记物使用

为了保证粪便标本收集的准确性和完整性,常使用肠道不吸收物质作为标记物。口服卡红后,大便呈红色,可在试验开始和结束时服用,作为划分实验期限的标志物。药用炭使大便呈黑色,亦可使用。此外,还可在每餐进食时加用另一种不吸收的标记物,用于校正粪便中该物质的含量。常用的有PEG、Cr2O3、CrCl351Cr。

标本收集

实验期第1日上午7时令受试者排空膀胱,将尿液弃去,然后收集每日24小时尿液。用浓盐酸防腐(每100ml尿液加0.5ml浓盐酸)。容器上需注明受试者姓名、实验日期等,以防混淆。测定每日尿液总量。留取部分尿液,置-20℃保存待测。

从第1次大便变为红色起,第2次服用卡红后至大便出现红色前,收集所有的大便。每日可用浓盐酸或20%硫酸20ml防腐。测脂肪一般用冰醋酸20ml防腐。粪便标本需储放阴凉处。将全部粪便标本移入捣碎机中,加适量蒸馏水,将大便捣成糊状。如标本较多,可分成数次进行,然后混匀所有标本。将糊状粪便标本倒入带塞的大号容器内,视标本量的多少稀释到1000~3000ml,用力混匀。记录大便总量,提取少量稀释好的标本用做样品。

膳食成分的测定有两种方法:一种方法是按照食物成分表计算,另一种方法是直接分析食物的样品。按照食物成分表计算的结果,只能供营养师配制膳食时参考用。不同时间和不同来源的食物成分可能有相当大的差异。计算结果与实际测定结果往往有较大的差别,原则上不能代替实际成分的测定,在进行研究设计、统计、分析等过程中应加以注意。准确的代谢研究必须采用直接分析法。食物的样品可于配制实验膳食时另外配制完全相同的一份作为分析用。但全份食物浪费较大,一般可用全份食物的1/3或1/5。标本处理方法同前。

实验期间活动

可进行适当的轻度体力活动。保证体重无明显变化。但要注意避免显性出汗。大汗可增加水、电解质和某些物质的丢失。

粪便和食物标本处理

可视测定内容的需要采用不同方法。

  1. 干灰化法:通过高温灼热使样本脱水、焦化。在空气中氧的作用下,使有机物氧化分解成二氧化碳、水和其他气体挥发,残留的无机物供测定用。该方法适用范围广,可用于很多微量元素的分析。操作简便,需要设备少,灰化过程中不需要人看守,并适合于大批量样品的处理,省时省事。缺点是由于敞口灰化,温度高,容易造成待测成分的挥发损失;其次是某些待测成分附着于坩埚的孔穴中很难溶出,致使回收率降低。
  2. 湿消化法:在样品中加入硝酸、高氯酸、硫酸等强酸,加热破坏有机物。硝酸是强氧化剂,但由于沸点较低,在高温条件下易扩散,氧化能力不持久。因此当消化过程需要补加时,应先冷却。其优点是对金属具有较强的溶解能力,除了金和铂以外,几乎能溶解所有的金属。高氯酸在低温时没有氧化能力,但加热时是一种强氧化剂,其氧化能力强于硝酸和硫酸,可分解所有的有机物,消化速度也快。但需注意,在高温下,高氯酸直接接触某些还原能力强的物质(如酒精、甘油、糖类、次磷酸及其盐)时,因反应剧烈有发生爆炸的可能,故一般不单独使用,并且要避免消化液烧干,以免发生危险。浓硫酸在加热条件下具有一定的氧化能力,但不如高氯酸和硝酸,它只能使样品中的蛋白质氧化脱氨,而不会进一步氧化成氮氧化物。浓硫酸对有机物有强烈的脱水作用,并使其炭化。此外,硫酸具有沸点高(338℃),不易挥发损失等优点。有时还需加入一些氧化剂(如高锰酸钾、过氧化氢等),以加速样品的氧化分解,完全破坏样品中的有机物,使待测的无机成分释放出来,并形成各种不挥发的无机化合物,以便做进一步的分析测定。

常用的消化方法:①硫酸消化法:如用凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量,可用此法来进行消化。由于硫酸的氧化能力较弱,消化液炭化变黑后,保持较长的炭化阶段,使消化时间延长。可适当加入某些氧化剂。②硝酸-高氯酸消化法:可先加硝酸进行消化,待大量有机物分解后,再加入高氯酸。此法反应速度快,炭化过程不明显;消化温度低,挥发损失少。但由于酸经加热容易挥发,故当温度过高、时间过长时容易烧干,并可能引起残余物燃烧或爆炸。③硝酸-硫酸消化法:在样品中加入硝酸和硫酸的混合液,或先加入硫酸。加热使有机物分解,在消化过程中不断补加硝酸。此法可缩短炭化过程和消化时间,反应速度适中。但因含有硫酸,不宜做碱土金属的分析。

解释结果需考虑实验本身的误差

完成标本测定后须审查浓度稀释过程与换算步骤,特别要注意稀释倍数的换算。尿、粪排出量可用肌酐和标记物校正。常用的参数:某物质平衡值=总摄入量-(总粪排出量+总尿排出量);肠净吸收率=(总摄入量-总粪排出量)/总摄入量×100%。

个体试验的正或负平衡值小于摄入总量的10%时,有可能是机体调节或试验误差所致,不一定具有重要的实际意义。并且因为该方法是一种传统的了解物质代谢平衡的方法,虽广泛应用于各种生理条件下各物质需求量和病理条件下某一物质代谢的研究,但它仅能反映整体的正负平衡变化,不能显示体内的代谢途径和详细变化,也无法计算内生性物质。此外,从皮肤、汗液、头发等部位丢失的部分无法计算,存在一定的局限性。

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