唾液腺细胞的原代培养

关于唾液腺肿瘤的分子生物学研究,除了以生物体组织材料进行研究以外,有很多工作可以利用体外培养的唾液腺细胞。作为研究对象的唾液腺细胞,可以采用已经建立的连续性(永生性)细胞系或细胞株,也可以从唾液腺组织的原代培养或有限细胞系中获得。实际上,目前很多关于唾液腺分子生物学的知识和信息,就是在体外培养唾液腺细胞的基础上获得的。

唾液腺细胞的原代培养:唾液腺细胞的体外培养遵循细胞培养的一般原则,但由于唾液腺细胞的生物学特性,在具体的一些操作步骤上,需要采取一些特殊的附加措施,以获取理想的培养效果。

正常唾液腺细胞的体外培养

唾液腺细胞培养的主要目的是获得分泌单位的上皮细胞,包括导管上皮细胞、肌上皮细胞和腺泡上皮细胞。在一般培养条件下所获得的细胞是混合在一起的上述多种细胞,如果要得到其中一种细胞,则需要采用细胞克隆技术。

常规方法获得唾液腺上皮细胞有一定的难度,唾液腺腺上皮细胞在体内与结缔组织有一层基底膜间隔,基底膜有半透膜性质,允许小分子物质通过,大分子物质如成纤维细胞和吞噬细胞则不能通过。在体外培养的细胞只能从细胞表面吸取营养,因而失去了细胞的极性。另外,在体外培养的细胞失去了体内严格的结构限制,成纤维细胞的过度生长可阻碍上皮细胞的生长增殖。因此,在体外培养中,保证营养供给以及如何抑制成纤维细胞的增殖,便成为唾液腺上皮细胞培养的关键。

长期以来,建立的多种正常唾液腺腺细胞体外培养的方法,都是设法抑制成纤维细胞的增殖,促进上皮细胞的生长,并使培养的唾液腺上皮细胞能在体外存活较长的时间,同时保持其特殊的结构和功能。为了达到这些目的,所采取的分离、培养措施,主要包括:采用特殊的培养液;加入有利于上皮细胞生长的因子如表皮生长因子、氢化可的松等辅助物质;培养器皿底部包被以特殊的底物如多聚赖氨酸、鼠尾胶原等等。正常唾液腺细胞体外培养最基本的方法,主要是一般细胞原代培养的两种基本方法:组织块(移植块)培养法和消化分散培养法,但在具体的方法步骤上需做一些调整和改进。如:①培养唾液腺上皮细胞所采用的培养液,一般在含有抗生素的DMEM或Ham's F-12合成培养液或二者的混合液中加入10%胎牛血清或10%~20%小牛血清,另需加入一定的辅助生长物质。常用的有:5μg/ml胰岛素,5μg/ml转铁蛋白,10ng/ml表皮生长因子,100ng/ml氢化可的松,10ng/ml霍乱毒素等。②如有条件,可用特殊的无血清培养基或低血清培养基,在无血清条件下,成纤维细胞贴壁受到抑制,上皮细胞也呈现出低分化现象,细胞具有较强的增殖分化能力。另外还有一些细胞专用培养基。③为了促进唾液腺上皮细胞的附着和生长,可在培养瓶或培养皿底部的表面涂布细胞外基质作为底物,常用的为胶原,可购买商品的胶原,或自行制备鼠尾胶原。

自制胶原的方法:于无菌条件下自大鼠取出尾腱,剪碎,浸泡于70%乙醇中消毒,过夜。次日取出,待干燥后,将尾腱溶于1∶1000醋酸中,于4℃下消化72小时。离心取上清液作为胶原储存液。使用时,将胶原储存液与培养液配制成胶原凝胶,铺于培养瓶的底部,待凝固后,加入少许培养液平衡后,弃去培养液,按细胞培养步骤进行操作。

除胶原外,也可用纤维连接蛋白、层黏连素、多聚赖氨酸等。细胞外基质Matrigel是鼠EHS可移植性肿瘤基底膜提取物,对于培养唾液腺腺上皮细胞效果较好。除常规组织块培养和消化法培养外,利用胶原、基质胶或人工合成的可降解高分子材料等作为支架进行立体培养则更好地模拟唾液腺细胞的体内环境,为唾液腺体外培养、组织工程研究以及肿瘤细胞体外生长研究提供更好的生存环境。

正常唾液腺上皮永生化细胞系的建立为唾液腺肿瘤发生的研究提供了良好的实验基础。

唾液腺肿瘤细胞的体外培养

唾液腺肿瘤细胞的体外培养一般可采用组织块培养法进行原代培养。其基本原则及方法与正常唾液腺上皮细胞的培养相同,对于一些分化程度较低的恶性肿瘤其培养条件可略简单,例如:培养液中可不加入生长因子等其他辅助物质,培养瓶底部也可不做铺底等特殊处理。但是对于一些良性及交界性肿瘤,如唾液腺多形性腺瘤,目前尚缺乏成熟、完整的培养体系,仍需优化其体外培养条件。日本学者通过对多形性腺瘤细胞转染人端粒酶反转录酶后,建立多形性腺瘤细胞系PA-hTERT细胞系,并成功传代达220次。国内学者采用组织块法,在RPMI1640培养基中体外培养多形性腺瘤细胞,建立多形性腺瘤有限细胞系(SPA-02),传代细胞保留了人唾液腺多形性腺瘤细胞的原代特点,并与原发肿瘤组织学特征相似。

无论是唾液腺正常细胞,还是肿瘤细胞的体外培养,均应进行细胞鉴定。培养中的腺泡上皮细胞呈多角形,细胞内含酶原颗粒,表达角蛋白(cytokeratin)、淀粉酶及过碘酸-Schiff(PAS)。导管上皮细胞形态为上皮样,不含酶原颗粒,表达角蛋白、前角蛋白、导管上皮细胞膜蛋白和分泌成分。肌上皮细胞呈星形、三角形或梭形,细胞内含肌丝,表达Calponin蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、S-100蛋白及波形蛋白等。

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