唾液腺的连续性细胞系

随着研究不断深入和体外培养条件的逐渐优化,已经有多个稳定的唾液腺正常及肿瘤细胞系建立,为唾液腺肿瘤的研究提供良好的实验材料。目前常用的唾液腺连续性细胞系有:

腮腺C5及C10细胞系

本细胞系来自以磷酸钙沉淀法转染含有复制缺陷SV40基因组质粒的大鼠腮腺腺泡细胞(Quisssell等,1998)。在30个克隆细胞系中,有2株具有中度至高度水平的细胞分化及唾液腺腺泡细胞功能,称为腮腺C5及腮腺C10。此两株细胞系的倍增时间分别为22小时及36小时。经对腮腺C5及腮腺C10细胞系进行功能研究,说明肾上腺素受体激活剂,如异丙肾上腺素、血管活性肠肽和前列腺素E1等均为产生细胞内cAMP的有效激活剂。脱羟肾上腺素、甲氨酸胆碱和UTP均可增加磷酸肌醇及细胞内钙的水平,但不增加P物质。利用间接免疫荧光分析,两细胞系均表达SV40大T抗原。电镜显示中度至高度细胞分化,保持细胞的复合连接和极性,并有中等量的分泌颗粒及粗面内质网。

Nagoya-78细胞

Nagoya-78细胞系来源于人唇小唾液腺的多形性腺瘤(Kondo等,1971),是建立较早的肿瘤细胞系。Nagoya-78细胞移植于仓鼠颊囊所形成的肿瘤呈恶性的组织学特征。染色体分析显示主要为62~65组染色体,含有5个标志染色体,并为三体性。Nagoya-78细胞的超微结构显示为上皮来源,有桥粒连接,PAS着色反映出在胞质中含丰富的糖原。尚不明确这些细胞来自腺体的哪一部分,但在相差显微镜下可见这些细胞为星状,提示肌上皮细胞起源的可能性。但也有人质疑,因未对细胞的肌上皮特性做进一步的确认,且在仓鼠颊囊形成的肿瘤是由多角形上皮细胞组成,而并不似肌上皮瘤。

HPA细胞

HPA细胞分离及克隆自人腭部小唾液腺的多形性腺瘤(Shirasuna等,1980)。原发肿瘤由闰管细胞和肌上皮细胞二者所组成。从原发肿瘤中根据其在软琼脂中形成克隆的能力筛选转化细胞,获得5株克隆。其超微结构均似肌上皮细胞,选择其中生长稳定的一株(HPA)。将HPA细胞移植于裸鼠可产生具有超微结构似肌上皮细胞的分化不良的肿瘤。在培养的细胞及裸鼠肿瘤的细胞胞质和细胞间隙中出现在原发肿瘤中未曾发现的病毒颗粒,其意义尚不清楚。培养的HPA细胞在电子显微镜下可见桥粒、微绒毛、肌原纤维、有膜包绕的液泡、扩张的粗面内质网、发育良好的高尔基体以及较大的椭圆形线粒体。免疫组织化学也显示HPA细胞对S-100蛋白和肌球蛋白(肌上皮细胞的特异标记物)染色阳性,以及对癌胚抗原弱阳性,后者当HPA细胞与HSG细胞共同培养时则可增强。此外,放射显影还显示在胞质中有催产素受体。总之,形态学和免疫学研究均表明HPA细胞为肌上皮细胞来源。

HSG细胞

于软琼脂中克隆出的HSG细胞系来自一口底鳞状细胞癌而作放射治疗的组织学良性的下颌下腺组织(Shirasuna等,1981)。HSG细胞由于其在软琼脂中形成了克隆的能力,表现有纤维蛋白溶解性。当注射于裸鼠时可发生腺癌,因而呈转化的表型。在培养中,这些细胞偶尔可形成腔状排列,并可借助与HPA肌上皮细胞共同培养而增强。超微结构检查可见立方状细胞,由含有桥粒及紧密连接的连接复合体所连接。此外,相邻细胞之间有由细胞质穿越的乳突状皱褶所形成的细胞间的指状突起结构。线粒体、粗面内质网和高尔基体常位于胞质的一侧。但缺乏张力细丝、肌原纤维、分泌颗粒(腺泡细胞的特征)以及基底部皱褶(纹管细胞的特征)。免疫组织化学检测HSG细胞显示癌胚抗原、分泌成分、乳铁蛋白、角蛋白、波形丝蛋白、结合蛋白以及原肌球蛋白阳性。并可见有人表皮生长因子和转化生长因子的分泌,和细胞表面人表皮生长因子受体的表达。正常时S-100蛋白并无表达,但当HSG细胞与HPA肌上皮细胞共同培养时,癌胚抗原表达增强,且S-100蛋白也出现表达。因癌胚抗原主要表达于正常腮腺的腺泡和闰管细胞,呈现此抗原证明HSG细胞来自闰管。另有学者提出,分泌成分、乳铁蛋白和角蛋白的表达表明HSG细胞尚保留体内闰管细胞正常表达的某些分化特征。HSG细胞的形态学和免疫组织化学特征均符合人下颌下腺的闰管导管细胞的特点。

HSY细胞系

本细胞系由闰管细胞组成的人腮腺腺癌所建立(Yanagawat等,1986)。转化的HSY细胞以下述方法分离:首先移植人肿瘤细胞于裸鼠,然后将自裸鼠肿瘤获得的移植核型细胞于软琼脂中进行克隆。在培养物中建立稳定的克隆,即HSY细胞株。核型分析显示至少有2个标记染色体。超微结构的特点为典型的上皮细胞特征,包括桥粒和紧密连接。并可发现有乳突状内折所形成的细胞间指状突。研究显示该细胞系含有分泌小泡伴以中等发育的粗面内质网和高尔基复合体。免疫组织化学显示在HSY克隆(株)中有淀粉酶(腺泡细胞分泌产物)存在。免疫电镜则显示有抗淀粉酶抗体呈阳性的胞质分泌颗粒。在细胞内及培养液中可测出人淀粉酶的酶学活性。在胞质中尚可发现抗血管活性肠肽和角蛋白抗体阳性的物质活性。但HSY细胞对抗神经微丝抗体不起反应,提示其并非神经起源。根据形态学和免疫细胞化学,HSY细胞似起源于人腮腺的闰管、腺泡部位。Hayashi等(1987)认为,HSY细胞来自闰管细胞,而有些腺泡表型成分的表达可能是转化过程所致。虽然HSY细胞确实有一些腺泡的特征,但其并不显示全部的腺泡表型,缺乏对α-肾上腺素能受体激动剂的反应性。此外,HSY克隆似可分化成肌上皮表型,若将这些细胞移植于裸鼠体内,可形成表达阳性淀粉酶(腺泡细胞标记物)或肌球蛋白(肌上皮细胞的标记物)的肿瘤(腺癌)。

ACC-2及ACC-3细胞系

唾液腺腺样囊性癌ACC-2及ACC-3细胞系分别取自腭部腺样囊性癌和腮腺腺样囊性癌的肿瘤新鲜手术标本,均经病理诊断证实(何荣根等,1988)。相差显微镜下可见细胞为多角形上皮样细胞,核大、类圆形,核浆比例增大,有多个核仁。胞质内见透亮度深浅不等的颗粒。可见有印戒细胞。细胞分裂像多见,并可见多极分裂。排列紧密时呈镶嵌状似铺路石样,高密度时可重叠生长,表现为接触抵制消失。接种细胞于裸鼠皮下,3~5周后均能生长成1cm直径以上的典型肿瘤结节。组织学显示肿瘤胞多数为立方形、多边形或锥形,少数为梭形。核分裂相多见,可见有异型核分裂和瘤巨细胞。细胞排列呈片状,部分呈巢状,部分肿瘤细胞有围成腔隙的倾向。组织化学检查结果显示,多数肿瘤细胞的胞质内有丰富的糖原,部分含有黏蛋白颗粒。扫描电镜见细胞为多边形,表面有较多的微绒毛。透射电镜下,细胞大多为多面体,核大。核内常染色质丰富,核仁多见。胞质内可见张力原纤维束,游离核糖体丰富,粗面内质网在各细胞的差别较大。有两种类型的分泌颗粒:一种为较均匀的电子密度增高颗粒,另一种电子密度较低,中央具有密度增高的中心。细胞间存在腔隙,相邻细胞间有桥粒连接。此两株细胞系来自腭部的小唾液腺和腮腺,可分别代表小唾液腺和大唾液腺的腺样囊性癌。

采用大剂量博来霉素(20μ/ml) /24h暴露法反复处理腺样囊性癌细胞系ACC-2细胞,获得耐药细胞系ACC-2/BLM。耐药指数为7. 299,与环磷酰胺、顺铂等抗癌药有明显的交叉耐药;与ACC-2细胞相比,ACC-2/BLM倍增时间延长,细胞周期中S期细胞减少,G1、G2期细胞增多。在含60μg/ml博来霉素的培养液中,分别培养9天后,ACC-2/BLM凋亡细胞明显少于ACC-2细胞。

ACC-M和ACC-LM细胞株

ACC-M和ACC-LM细胞株是将已经建立的SACC(唾液腺腺样囊性癌)细胞系,经尾静脉注射到裸鼠体内血液循环系统,帮助有转移能力的细胞进入转移的预备状态。当有肺转移灶形成后,体外培养稳定细胞,反复这一过程数次,每重复一次体内-体外筛选,肺转移的发生率提高一次,直至细胞的肺转移能力稳定在较高水平。然后进行克隆化培养得到高转移细胞株,ACC-M肺转移率为96%和ACC-LM细胞株肺转移率为85%。肺高转移潜能SACC细胞系的建立,为唾液腺SACC转移机制的研究提供了更理想的模型。

SACC-83细胞系

SACC-83细胞系来源于病理诊断为舌下腺腺样囊性癌的手术标本。1990年李盛琳等利用1例舌下腺SACC患者术后标本,建立了人SACC细胞系,命名为SACC-83(salivary adenoid cystic carcinoma-83)。形态学显示:细胞呈多角形镶嵌排列,核大,不规则,核浆比例增大,核仁清晰,一般2~3个。并可见巨大融合细胞,其胞质内有多个空泡。透射电镜下可见细胞核大,不规则,呈卷曲状。胞质内有较多的核糖体,线粒体增多,粗面内质网较少,未见高尔基体,可见分泌颗粒。从细胞生长曲线观察可发现传代后第2天开始呈直线上升,第7天开始下降。计算细胞分裂指数显示第5天为分裂高峰期。染色体分析可见染色体数目主峰范围在98~100个,占17%为亚四倍体。于裸鼠背部、腋下或腹股沟接种细胞后可生长肿瘤,成瘤率100%。显微镜下,移植肿瘤与原部位癌组织像相类似,均为腺样囊性癌。

MEC-1细胞系

MEC-1细胞系的组织来源取自一腭部黏液表皮样癌,并经病理诊断证实(司徒镇强等,1990)。本细胞系的细胞呈贴壁生长,细胞接种后4~8小时即大部分贴壁,4小时贴壁率为86. 9%。根据细胞生长曲线显示,接种后第1~3天细胞增殖较慢,继而迅速上升,第5、6天达高峰。群体倍增时间约30小时,分裂指数高峰值为27‰。细胞经冻存、再复苏后,其生长方式及细胞形态学特点与冻存前相同。贴壁生长的细胞呈镶嵌排列。细胞大小不一,多为多角形上皮样细胞,少数为卵圆形,可见多核巨细胞或巨核细胞。细胞核一般较大,核浆比例高,核多为卵圆形或圆形,并可见异形核。核仁清晰,大小不一,一般为2~5个。可见核分裂相,偶见多核分裂及异常核分裂。透射电镜下,细胞多为多角形,核较大而胞质较少。细胞的游离面可见微绒毛,偶见桥粒。胞质内粗面内质网较丰富,有张力原纤维存在。可见散在的线粒体。免疫组织化学检测显示细胞对于抗角蛋白抗体阳性,对于抗Sc抗体和抗溶菌酶抗体呈现不同程度的染色。染色体分析显示细胞为亚二倍体,染色体数目以44~46条者为主,其中以44条者最多见。以细胞悬液于裸鼠的肩胛及臀部皮下注射,可产生瘤结节,成瘤率100%。移植肿瘤标本组织学切片显示:肿瘤由上皮样细胞组成,细胞成团片,少数区域有腺样结构,细胞大小不等,可见核分裂相,偶见黏液细胞,病理诊断为黏液表皮样癌。鼠抗人角蛋白抗体染色阳性,兔抗人分泌成分(SC)抗体和兔抗人溶菌酶抗体染色均阳性;细胞为单层生长,铺满瓶底后出现漂浮细胞,重叠生长现象少见。

1998年该课题组又通过裸鼠尾静脉注射MEC-1,筛选出高转移细胞克隆Mc3,与其母本细胞MEC-1比较,Mc3具有生长较快,S期细胞比例较高,接触抑制能力下降(饱和密度高),在软琼脂内克隆形成率高,野生型P53蛋白表达阳性率低,裸鼠实验性肺转移率高等生物学特点,表明Mc3是一个高转移细胞系。Mc3细胞经裸鼠唾液腺移植,鼠间原位移植后获得转移力提高的M3SP2细胞系。杨宏林等将Mc3经尾静脉注射获得截瘫的裸鼠,取其脊髓培养,建立了细胞系Ms,与Mc3相比,Ms增殖速度和克隆形成率均较高,但裸鼠皮下接种成瘤速度慢。

2002年该课题组在MEC-1细胞系的基础上建立了耐药细胞系MEC-1/FU,耐FU剂量为1. 980μg/L,与MEC-1相比,该细胞系增殖略快,软琼脂克隆形成率明显提高,S期细胞增多,部分解释了其耐药性产生的基础。2009年缪叶等应用裸鼠体内成瘤加药物诱导建立了人黏液表皮样癌耐药细胞系Mc3/5-FU,并检测了Mc3/5-FU细胞的生物学特性,MC3和MC3/5-FU细胞均为单层贴壁生长,局部可见重叠生长,增殖活跃,两种细胞形态及超微结构未见明显差别。MC3/5-FUM与C3细胞的群体倍增时间分别为55小时和60小时。MC3/5-FU细胞对于5-氟尿嘧啶(5-FU)、博来霉素(BLM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、顺铂(CDDP)的耐药倍数分别为13. 3、4. 2、6. 5、6. 9、0. 7。另外,多药耐药基因(MDR-1基因)在MC3/5-FU中表达高于MC3。而免疫组化结果显示,P糖蛋白(P-gp)在MC3/5-FU呈阳性表达,而在MC3则未见表达。

这些耐药细胞系的建立为临床唾液腺黏液表皮样癌的治疗及其所产生的耐药机制的研究奠定了基础。

NACC细胞系

NACC细胞系来源于人腭部小唾液腺腺样囊性癌组织,经原代培养并传代成系,命名为NACC细胞系,由农晓琳等建立(农晓琳等,1999)。该细胞系含有多种形态的细胞,方块形细胞可能为闰管细胞,类梭形细胞为肌上皮细胞,核大、细胞质及细胞器少的可能为未分化多能干细胞。该细胞4小时贴壁率为70%,高峰期分裂指数为6. 8%,染色体为68~70条,亚三倍体占90%以上,这与SACC-83细胞系亚四倍体不同。裸鼠皮下接种成瘤率为100%。培养中可见分泌黏液样物质,免疫组化显示NACC 及SACC-83细胞均对抗keratin、GFAP、EMA、SMA、vimentin、S-100蛋白等抗体呈不同程度阳性表达。

PA-hTERT细胞系

PA-hTERT细胞系来源于人类腮腺多形性腺瘤(Masae Kitagawa等,2007)。取原代培养多形性腺瘤第六代细胞并转染人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT),建立永生化唾液腺多形性腺瘤细胞系,可以连续传代200次以上。PA-hTERT细胞由分泌性上皮细胞和肿瘤性肌上皮细胞组成,免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白(cytoketatin)及波形蛋白(vimentin)强阳性表达,并且与祖系多形性腺瘤细胞的多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1,PLAG1)基因表达水平一致,具有与原发多形性腺瘤相似的的生物学特性。

SMG C6及C10细胞系

本细胞系来自用含有复制缺陷SV40基因组的质粒以磷酸钙沉淀法转染的大鼠下颌下腺腺泡细胞(Quisssell等,1997)。在27个克隆细胞系中,获得株具有中度至高度水平的细胞分化及唾液腺腺泡细胞功能,称为SMG C6及C10细胞。经SMG C6及C10细胞系的功能研究,说明肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素、血管活性肠肽(VIP)和前列腺素E1均为细胞内cAMP的有效激活剂。肾上腺素、去甲肾上腺素、脱羟肾上腺素、乙酰胆碱、P20-嘌呤受体激动剂对增加磷酸肌醇的产生及细胞内游离钙水平有效,但对P物质则无效。利用间接免疫荧光分析,两细胞系均表达富谷酰胺/谷氨酸蛋白(下颌下腺腺泡细胞特异性分泌蛋白)。电镜观察显示保持复合连接、细胞极性,并有中等量的分泌颗粒及粗面内质网。这两个细胞系的倍增时间为25小时。

RSMTx细胞

RSMTx是一株克隆的唾液腺细胞系,由一只刚断奶的大鼠正常下颌下腺组织经致癌物处理并长期培养后建立的(Brown等,1989)。RSMTx是转化细胞系,其上皮性质已由形态学及免疫细胞化学研究所确定,其特异性上皮特征的表达可因细胞传代数的不同而相异。例如,传代早期的细胞(4~12代)呈现为含有紧密连接和桥粒的末端杆状结构,而传代晚期的细胞(13~80代)则无这些特征。然而,传代晚期的细胞仍然保留某些上皮的特性,免疫细胞化学证实其持续表达角蛋白及上皮膜抗原。也可利用对RSMTx细胞表面抗原的抗体作免疫细胞化学检测来说明RSMTx细胞可能来源于腺体的导管区域。上述结果提示,RSMTx细胞是一株来自大鼠下颌下腺导管区的上皮细胞系。

563细胞

563细胞系来自一死于皮肤恶性肿瘤雄性狗的下颌下腺(Strandstrom等,1989)。起源的唾液腺组织无肿瘤特性,建立的细胞无病毒感染。但尚未确定563细胞是否可以转化(即有能力在软琼脂中形成克隆或在裸鼠形成肿瘤)。染色体结构可见有异常。超微结构观察显示有上皮细胞的特点,包括桥粒、张力细丝、紧密连接及在细胞间的隐窝中有细胞突起。此外,这些细胞还含有中间丝,但无明确的分泌颗粒。免疫组织化学显示其他上皮特性,如表达角蛋白和上皮膜抗原。这些细胞似为腺组织起源,但其起源的特异性部位尚不清楚。

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