唾液腺肿瘤的基因治疗:目的基因的导入及启动

能将目的基因导入靶细胞的运载工具称为载体(vector)。目前,用于基因治疗的载体主要有两种:病毒载体和非病毒载体。

病毒载体

病毒可自然感染细胞,它本身就有一套机制可将基因送入细胞核,它能作为转基因载体高效地传递外源性DNA序列进入哺乳类细胞。这些病毒载体主要有:

一、反转录病毒(retroviruses):是首先申请作为载体的一种病毒,也是目前应用较为广泛的一种载体。反转录病毒是一种RNA病毒,它在穿入细胞之后进行复制。在细胞内经病毒编码的反转录过程产生一个双链DNA中间体,称为前病毒(provirus)。前病毒进入细胞核内,与宿主细胞的基因组进行随机整合。前病毒是DNA前病毒,但它是有与该病毒相同的基因结构:LTR-gag-Pol-env-LTR。左侧LTR常作为转录的终止信号。Gag基因能编码病毒内部的结构蛋白,Pol编码反转录酶、核酸内切酶等,env编码外壳糖蛋白。此糖蛋白位于病毒表面,使病毒具有感染性。病毒基因融合到宿主染色体上是反转录病毒复制过程的基本部分。

反转录病毒作为基因治疗的载体具有许多优点:首先,前病毒与被感染的细胞的基因组DNA结合,并在随后的细胞分裂中保持下去,将外源性基因传递给子代细胞。其次,经反转录病毒导入的外源性DNA能与靶细胞基因永久地融合,适合于疾病的治疗和长期的基因表达。再者,由于前病毒具有上述结构,可以减少基因重排的可能性,转移的基因型为单拷贝,能够长期有效地表达。经过大量的动物实验和临床前实验,证明反转录病毒作为载体具有安全可靠的范围。但反转录病毒也具有一定的局限性,它仅仅能整合到增殖分裂活跃的细胞中。而任何部位的实性肿瘤,其细胞成分尚不均匀,肿瘤组织中的细胞常处于细胞周期的不同阶段,有些细胞甚至处于相对休眠状态。因此,并不是所有的肿瘤都对反转录病毒的转染同等敏感。仅有5%的实体肿瘤细胞群能被反转录病毒转染。所以在肿瘤基因治疗中,反转录病毒效率较低。另外,反转录病毒能够容纳外源性基因的长度限制在8kb之内,对一些较大的基因转移不太适合。反转录病毒较不稳定,容易在纯化过程中使env编码的糖蛋白损失,降低感染性。

二、腺病毒(adenovirus):腺病毒是一类重要的基因转移工具,在唾液腺肿瘤及头颈部肿瘤的基因治疗研究中应用较多。腺病毒是一种线性双链DNA,它能转移较大的外源基因,并能感染非分裂相的细胞。但腺病毒载体转移的基因不能与宿主细胞的基因组整合,而是暂时表达。所以这种表达不能长期稳定下去。

三、腺相关病毒(adeno-associated viruses,AAV):腺相关病毒在人类分布很广泛。该病毒基因非常小,由于该病毒基因组很有限,所以它在细胞内复制之前需要一种疱疹病毒。腺相关病毒能感染大多数靶细胞,但它不会复制感染。它能整合到宿主细胞19号染色体长臂区域,并能整合到非分裂相的细胞,转导率较高。腺相关病毒的这种定点整合可使宿主细胞该区域的染色体重排。这可能与慢性B细胞白血病有关,所以腺相关病毒在人类癌基因治疗中的作用仍在研究中。

四、疱疹病毒(herpes virus,HV):疱疹病毒介导的基因转移也是一种暂时性表达。单纯疱疹病毒对转移基因进入头颈部肿瘤中可作为一种较好的载体。该病毒可在实验室内繁殖达到一个很高的滴度。疱疹病毒能感染非分裂像细胞,与腺病毒和腺相关病毒一样。但该病毒是人类的一种病原体,因此在它被用作载体之前必须进行很好的改良。它的基因组大而复杂,许多片段可被删除,留下一个间隙插入较大序列的基因物质。目前,以HSV-1为基础的载体正发展成为脑与头颈部肿瘤基因转移的载体。HSV有一个启动子,当病毒以它潜伏的形式存在于神经系统组织中时,启动子便开始启动。

非病毒载体

虽然病毒载体能够高效地导入目的基因,并作为基因转导工具被广泛地应用,但仍存在着局限性,如病毒性载体可诱导机体产生某种程度的免疫反应,存在着插入突变等致瘤及致毒的风险,而且病毒载体的容量有限,制备滴度不高等等。而非病毒载体则具有无传染性,不限制载体容量,可大量制备及具有靶向性等优点。理想的非病毒载体需要满足以下条件:①保护DNA不被细胞外DNA降解酶的降解;②携带DNA穿透细胞膜;③保护DNA在进入细胞核之前不被细胞内溶酶体和酶等降解;④能有效将有活性的基因插入目的区;⑤可生物降解,从细胞中消除;⑥无细胞毒性。目前应用的非病毒载体种类主要有以下几种:

一、阳离子多聚物载体:即利用阳离子多聚体,如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与DNA上的负电荷结合发生电性中和,而形成稳定的多聚物/DNA复合物。复合物仍带正电荷,可与细胞表面带负电荷的受体结合,而被渗入至细胞内。如聚乙烯亚胺(polyethylenamine,PEI)、聚丙烯亚胺树突状物(polypropylenimine dendrimers),聚酰胺树突状物(polyamidoamine dendrimer)、多聚赖氨酸、多聚组氨酸、多聚精氨酸、鱼精蛋白、壳聚糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇(PEG)修饰物等等。PEI可抑制溶酶体,在吞噬泡酸性环境中质子化、正电荷增加,对DNA提供更大的保护作用,有利于质粒逃离吞噬泡。PEI糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性,阳离子多聚物/DNA混合物经PEG修饰后,可形成囊泡状结构,屏蔽表面多余的正电荷,有利于体内应用。

二、纳米颗粒载体:纳米颗粒载体介导基因转染具有其他非病毒载体所没有的优势。首先,纳米颗粒在一定范围内的颗粒数目对细胞的生长及活性无明显影响,细胞毒性和遗传毒性较其他载体低很多;同时纳米载体不存在免疫原性,因而不会导致免疫反应的发生。其次,纳米颗粒传递基因的效率较高。很多纳米材料作为载体传递基因的效率与脂质体相当甚至高于脂质体。第三,由于自身体积小,纳米颗粒可以在血管中随血液循环,并可通过血脑屏障到达身体各组织中。最后,纳米颗粒在体内的循环时间明显长于普通大小的颗粒,在短时间内不会很快被吞噬细胞清除,从而可以延长与细胞的接触时间,提高转染效率。另外,纳米颗粒还可与DNA形成致密结构,使DNA不被核酸酶消化降解,有浓缩保护DNA的作用。

目前研究较多的纳米粒主要有无机纳米粒(如磷酸钙、磁性氧化铁)、固体脂质纳米粒、可降解聚合物纳米粒(如PLA、PLGA)、天然高分子纳米粒(如壳聚糖及其衍生物)、有机硅纳米粒等。

2007年Harashima提出的基于程序组装的一种新型的复合载体系统的多功能信封式纳米载体(multifunctional envelope-type nano device,MEND)。理想的MEND是由压缩的DNA核心和含有靶向因子及功能配体的脂质信封外壳构成。首先,采用多聚阳离子如PLL、PEI将DNA压缩,以保护DNA不受核酸酶的降解,控制DNA复合物的大小及提高DNA的包封率。其次将多聚阳离子/DNA复合物通过与脂质体间的水合作用和静电相互作用包裹入脂质体中。最后对脂质体进行修饰达到不同的功能,如PEG化和靶向作用。这种新型的复合载体系统综合了各种载体系统所具有的优点,具有显著的促进基因的细胞转染潜在优势,因而有着广阔的发展前景。

三、脂质体或脂质体复合物:脂质体是由脂质双分子层组成的颗粒,可介导基因穿过细胞膜。最常用的脂质体为阳离子脂质体,如商品用lipfectin,阳离子脂质体结构一般包括疏水基团和氨基基团,增加分子中氨基基团的数目,以及增加氨基基团与疏水基团之间的距离有利于增加DNA的释放能力。主要由带正电荷的脂类及中性辅助脂类等摩尔混合而成。带阳性电荷的脂质体与带阴性电荷的DNA之间可有效地形成复合物,并通过内吞作用移入细胞内。

四、天然高分子材料:天然高分子生物材料如胶原、透明质酸、壳聚糖和海藻酸盐等被用于基因药物载体的研究。其中壳聚糖及其衍生物在基因载体系统的研究最为广泛。

五、配体介导的靶向载体:要使非病毒载体能在肿瘤细胞或特异组织中定向迁移并携带DNA进行细胞转染,就需要在载体表面进行靶向基团修饰,使其具有靶向特异性。叶酸、转铁蛋白、半乳糖、TAT肽及胆甾醇等靶向配体耦合于载体上可以提高载体的靶向性。

目前,所知的临床研究方案中,脂质体是除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法,特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。尽管非病毒载体可避免引起病毒载体所带来的毒副作用,但质粒DNA和脂质体复合物与腺病毒一样,也可引发炎症。非病毒载体易于制备,并能形成规模生产,但基因转移和表达效率较低仍是困扰它发展的主要障碍。

最近研究结果表明,超声波有助于提高质粒的转移效率。超声波配合微泡回声比差剂可提高细胞膜的通透性,从而显著提高裸DNA的转移和表达效率。这项胞膜渗透技术可在细胞膜表面瞬间制造小孔,DNA则趁机进入细胞内。

非病毒载体介导的基因转移方法

一、DNA—磷酸钙共沉淀法:磷酸钙共沉淀法是由Graham等于1973年首先建立的。最早用于将外源基因转入培养的单层细胞,其机制可能是Ca2+-DNA结合物形成的颗粒沉积在培养的细胞表面,导致细胞非特异性内吞。转染效率取决于沉积反应和形成颗粒的大小,对于不同类型的细胞其转染效率有所不同,目前仅用于体外培养细胞的基因转移。

二、直接注射法:将裸DNA直接注入单个细胞或组织内,分为显微注射法和注射法。显微注射法DNA转移效率高,准确快速,但转染的细胞数目有限,不适合大量细胞的转染,主要用于转基因动物的制备。注射法简便,但是DNA转染效率低,常与下述电穿孔法联合应用。

三、电穿孔法(电脉冲介导法):将细胞置于高压电场,借助高压短脉冲电流的作用使细胞膜出现瞬间微小的孔隙,这些微孔主要分布在靠近电极的细胞表面,从而提高细胞膜对外源DNA的通透性。DNA分子直接通过这些微孔,或者当微孔闭合时伴随膜组分的重新分布进入细胞质中。

电穿孔的基因转移效率很高,而且操作简便易行,因此这项技术广泛用于克隆化基因的瞬时表达。有报道电穿孔法可使大多数细胞系及一些原代培养细胞的瞬时转染效率达到90%。影响电穿孔法基因转移效率的因素主要有脉冲的最大电压、持续时间以及受体细胞的类型。近年来电穿孔技术已经应用于活体基因转移,多种组织如皮肤、肌肉等都有利用电穿孔技术成功介导基因转移的报道。电穿孔可明显提高基因的转移效率,有研究报道对小鼠的骨骼肌细胞加一个脉冲电场,能使外源基因的表达量增加100倍。最近在体内深部组织基因转移的应用也获得较大进展,如在活体视网膜基因转移方面的应用取得了较高的转染效率。

四、基因枪(微粒子轰击法):是一种在高压电极作用下,与微小金颗粒或钨粉结合的DNA,瞬间穿透细胞的细胞膜,进入靶细胞、组织和器官的基因转移方法。微粒子进入细胞后,DNA逐渐从粒子中释放出来,开始表达。基因枪技术具有操作简捷、安全、有效、不损伤靶细胞原有的结构等优点。最近多篇文献报道了使用内镜式基因枪将外源基因成功导入小鼠肝脏的例子。

五、脂质体转染法:非病毒载体中最具代表性的是阳离子脂质体(cationic liposome),它具有可自然降解、无免疫原性等优点,已成为重要的体外基因转移介质。阳离子脂质体通常由一个单一的阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成。阳离子脂质体与DNA通过静电作用相结合,构成脂质体—质粒复合体。脂质体—质粒复合体通过脂质之间的相互作用,与靶细胞融合进入细胞内,分解并释放质粒DNA,最后DNA进入细胞核并在其中表达。影响阳离子脂质体介导的外基因表达的因素较多,不同细胞、不同时间、不同结构及比率获得的转移效率可能不同。因此,应根据不同的细胞类型,选用不同的阳离子脂质体,优化阳离子脂质体与DNA比率提高转移效率。

六、超声法:随着超声造影剂的问世,人们借助于超声与超声造影剂的DNA在靶组织与器官中释放并转染周围的组织细胞。超声法的特点是无创,并可作用于深部的组织和器官,是一种新型的基因靶向传输技术。不仅超声照射本身可促进目的基因在体内外的转染与表达,而且超声介导的微泡造影剂依赖空化效应进一步增强基因的转染效率。超声介导的基因转染与超声照射的时间、超声波的频率、强度以及DNA的浓度有关。

基因表达的启动子

启动子(promoter)是DNA聚合酶的结合序列,能引导某个基因的转录。基因治疗必须具备一个活性启动子的启动,允许转录的外源性基因在细胞中表达。启动子的种类很多,组织特异启动子具有的优点是它们只允许基因在靶细胞中表达而不在其他细胞中表达。不同的启动子活性水平有很大差异,从而导致不同细胞中基因表达的程度也有很大差别。此外,不同的启动子活性持续时间也不同。

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