唾液腺肿瘤基因治疗战略

唾液腺肿瘤的发病机制非常复杂,涉及多种基因的改变。有的是原癌基因的激活,有的是抑癌基因的失活。关于唾液腺肿瘤基因治疗战略可从以下几个方面进行探索:

“自杀”基因的实施

“自杀”基因(suicide gene)在癌症治疗战略的实验研究中是采用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase gene,HSV-tk)。这种基因编码一种磷酸化酶,该酶不在正常人的体细胞内表达。这种酶作为一种前药激活剂发挥作用。当给予抗疱疹病毒药物ganciclovir转变成毒性的三磷酸形式,使该细胞受到破坏。Sewell等应用腺病毒载体介导HSV-tk基因进入口腔鳞状细胞癌的动物模型,随之注射抗病毒药物ganciclovir后,肿瘤出现退化。比较不同剂量的腺病毒在引起肿瘤消退上并没有明显的统计学差异。

O'malley等采用病毒载体介导鼠疱疹胸腺嘧啶核苷激酶(tk)和细胞介素(MIL-α)治疗鼠唾液腺癌。首先经皮肤注射5×105个鼠鳞状细胞癌细胞进入CH/HeJ鼠的下颌下腺产生唾液腺癌。1周后,在建立的下颌下腺肿瘤模型上注入含有治疗基因和控制基因的重组腺病毒。动物继而服用ganciclovir,每日2次(25mg/kg),持续6天。所有接受了胸腺嘧啶激酶和ganciclovir的动物显示了肿瘤的退化。与此同时,配合使用胸腺嘧啶核苷激酶与白介素-α(tk+MIL-α)进行治疗,效果更明显。所有经过治疗后残存的肿瘤以及对照组都进行了免疫组织化学染色和镜下观察。特殊的免疫染色显示在经MIL-α治疗后的动物肿瘤中,有明显的CD8+淋巴细胞浸润。推测是由局部的白介素表达而导致的免疫反应。这种CD8+T淋巴细胞在肿瘤局部浸润,对杀伤肿瘤细胞,促进肿瘤细胞消退具有重要的作用。Shillitoe等应用基因枪转移携带有一个标记/自杀融合基因,即β-半乳糖苷酶-胸腺嘧啶激酶(beta-galactosidase-thymidine kinase,GALTEK)的质粒进入体外培养的口腔癌细胞内。同时将这种转运方式与腺病毒载体相比较,发现这种基因枪的转录效率只有13%,在有抗疱疹病毒药物ganciclovir存在的情况下,仅有24. 3%的细胞生长受到抑制。而利用腺病毒载体,其转导效率在54%以上,在有ganciclovir存在的情况下,所有培养中的口腔癌细胞生长均受到抑制。

“自杀”基因的治疗方案有待成为唾液腺肿瘤及口腔癌基因治疗的一种有力手段,其中采用腺病毒载体更为有效和稳定。

免疫性基因治疗

采用几种途径扩大免疫反应,在唾液腺肿瘤及头颈部肿瘤的基因治疗中可发挥作用。

基因修饰的TIL

1989年,美国联邦政府批准的首项人类基因工程实验是将基因标记到免疫细胞,特别是肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)转移到患有进展性癌的患者身上。这些淋巴细胞是T细胞,直接从肿瘤中分离出来,在T细胞生长因子白介素-α(IL-α)存在的组织培养中大量生长,以TIL配合大剂量的IL-α给患者静脉内注射。约有35%~40%的患者对该项治疗有效。

该项实验依据的原理是,T淋巴细胞在肿瘤免疫中起着非常重要的作用。肿瘤组织中或肿瘤转移的淋巴结中的T淋巴细胞,特别是细胞毒T淋巴细胞(CD8+T淋巴细胞)能识别和杀伤肿瘤细胞。将这些细胞在体外进行单细胞培养,IL-α存在的情况下,T淋巴细胞生长繁殖,其他细胞逐渐死亡,能存活的细胞为TIL。TIL被认为是肿瘤细胞“致敏”的T细胞,对肿瘤细胞具有很强的针对性。TIL配合IL-α治疗恶性黑色素瘤和一些进展性癌,肿瘤的消退率在38%左右。

为提高TIL的治疗效果,可将某些细胞因子(TNF,IL-α)基因转导修饰TIL,然后回输这种基因修饰的TIL,在肿瘤局部达到有效浓度的细胞因子,通过细胞因子基因在TIL细胞中的表达,增强TIL杀伤肿瘤的能力。同时利用TIL能回到肿瘤部位,并在肿瘤部位聚集的特点,把TIL作为一种基因运载载体将一些抗肿瘤活性的细胞因子(IL-α、TNF-α)基因插入到TIL中,将抗肿瘤的细胞因子基因带到肿瘤部位,分泌细胞因子,达到局部的高浓度。避免了细胞因子半衰期短,及静脉给药引起的全身副作用。Tan等进行的一项临床实验表明,将反转录病毒介导的白介素-2(IL-2)导入到肿瘤细胞浸润淋巴细胞(TIL)中,然后再把这些淋巴细胞回输到进展期肺癌患者的基因治疗中,采用含有人体IL-2基因的反转录病毒质粒PL(IL-2) SN分别转导来自每一患者的TIL细胞,将大约1×106~1×1010个携带有IL-2的TIL细胞回输到患者胸腔中。3/5的患者在至少4周内没有出现胸膜渗出,其中1例患者不仅没有胸膜渗出,而且经CT检查发现原发肿瘤灶体积缩小。

在唾液腺及头颈部肿瘤中,肿瘤灶内或肿瘤周围常出现淋巴细胞浸润,采用基因修饰的TIL可使TIL进入一种激活的细胞类型,更有效地杀伤肿瘤细胞。同时也使插入的细胞因子基因在肿瘤局部得到高表达,发挥细胞因子抗肿瘤能力。这也将是唾液腺肿瘤基因治疗的又一新途径。

基因修饰的肿瘤细胞

将引起具有较强免疫刺激作用的细胞因子(IL-2、IL-4)基因转移到肿瘤细胞上,改变肿瘤细胞的基因结构,增强肿瘤细胞的抗原性,刺激特异免疫系统消除肿瘤。动物实验发现,将小鼠肿瘤细胞在体外进行培养,插入细胞因子基因后再植入到小鼠体内,可导致机体对基因改变的肿瘤细胞进行免疫性破坏。从肿瘤患者体内切除的肿瘤组织,在体外进行培养后,插入免疫调节因子基因,再回输到患者体内诱发免疫反应。这一方案已被批准用于人体实验。采用反转录病毒载体TNF-α、IL-2GM-CSF基因在体外插入到肿瘤,用于治疗恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肾细胞癌和肺小细胞癌。这项利用自体肿瘤细胞作为基因转移的靶细胞,经过基因修饰后再回输体内。其优点是能够刺激和增强机体的抗肿瘤的免疫功能,同时这种基因修饰的肿瘤细胞也可成为一种抗肿瘤的“疫苗”。其困难是仅有50%的肿瘤细胞可在体外进行长期培养以用于基因转移。因此采用基因修饰自身肿瘤细胞作为“疫苗”的方案受到限制。美国纽约Memmorial Sloan-Kettering癌症中心采用IL-2修饰deHLA-A2匹配的异体黑色素瘤细胞或肾癌细胞分别治疗黑色素瘤患者或肾细胞癌患者。

对肿瘤细胞的另一项基因修饰是在肿瘤细胞原位上进行基因改变。此项基因治疗的临床研究用于黑色素瘤。将含有HLA-B7(human leukocyte antigen B7)基因的脂质体直接注射到恶性黑色素瘤的局部。这种含有抗原基因的脂质体经过吞噬作用进入肿瘤细胞,使肿瘤细胞在其表面表达外源基因。肿瘤细胞表达异体HLA-B7抗原后,使机体免疫细胞增强了识别和抗肿瘤的能力。

替代性基因治疗

抑癌基因的失活在肿瘤的发生中起着重要的作用。p53基因是目前研究较多的一种抑癌基因。p53基因编码的是一类半衰期较短的核磷酸蛋白,这种蛋白与肿瘤的抑制有关。它能促进细胞的分化和抑制肿瘤细胞的增生。当细胞DNA损伤时,野生型P53蛋白有助于DNA的修复或细胞程序性死亡(凋亡)的启动。基因的突变与人类许多肿瘤的发生有关。在唾液腺上皮性肿瘤中,p53基因也发生了突变。从理论上探讨,将野生型p53拷贝插入到p53缺失或p53有突变的肿瘤细胞中,可以抑制肿瘤的生长或逆转肿瘤的恶性表型。这一战略是抗肿瘤基因治疗的一个重要的组成部分。动物实验已经显示,插入正常的抑癌基因无论在体内或体外均可导致肿瘤的破坏。Ohashi等利用重组腺病毒携带野生型p53(AdcAp53)对胃癌进行体内和体外实验。体外实验在胃癌细胞系上进行。结果发现,AdcAp53对带有突变型p53的胃癌细胞有特异性的生长抑制作用,而对带有野生型p53细胞系则没有明显的影响。通过流式细胞分析,发现DNA降解碎片,认为AdcAp53杀伤胃癌细胞的机制是通过细胞凋亡。体内实验在裸鼠身上进行,直接注射AdcAp53到皮下肿瘤,发现具有p53突变的MKN1肿瘤受到明显的生长抑制,而含有p53野生型的MKN45肿瘤细胞没有受到明显的影响。表明野生型p53基因抑制p53突变的肿瘤生长。Li等采用腺病毒载体介导重组野生型p53基因(Ad5CMV-p53)对人体鼻咽癌进行体外实验。采用Ad5CMV-p53分别感染两株人体鼻咽癌细胞系CNE-1和CNE-2Z,在感染后24小时配合电离辐射。对存活的细胞进行分析,在琼脂糖电泳上发现DNA降解梯带,表明出现细胞凋亡。认为电离辐射与Ad5CMV-p53对癌细胞具有协同作用,抑制肿瘤细胞生长的机制仍是通过细胞的程序性死亡。

这些相同的采用重组腺病毒携带野生型p53肿瘤抑制基因对肿瘤进行研究的还有卵巢癌、肺癌和乳腺癌。此外,采用p53基因与抗生素的抗性基因(如新霉素抗性基因neo)一起导入肿瘤细胞中,以野生型p53基因转导的肿瘤细胞出现明显的生长抑制或停止。

p53基因替换性疗法相同的是另一种抑癌基因RB的替换性治疗。体外实验发现,当细胞由非肿瘤状态转变为肿瘤时,细胞内RB mRNA水平以及核磷酸蛋白和磷酸蛋白的含量明显降低。将携带有野生型RB基因的反转录病毒载体导入视网膜细胞瘤细胞后,发现癌细胞的形态学发生了改变,将这种已转导野生型RB基因的肿瘤细胞接种裸鼠之后不再形成肿瘤灶。采用新霉素抗性基因与含有SV40启动子的鼠RB cDNA一起导入鼠乳腺癌细胞内,含有低水平的内源性RB mRNA的细胞得到稳定的转导并显示出RB的表达量增加。这些被转导的细胞在形态学上出现在了改变并在体外培养中生长速度明显减慢。在唾液腺许多上皮性肿瘤中,p53基因与RB基因也可见有突变。因此,替换性基因治疗也为唾液腺肿瘤的基因治疗提供了可行性手段。

反义基因治疗

在唾液腺肿瘤中,大多数肿瘤涉及多种癌基因的激活。而肿瘤细胞的恶性表型又依赖于特定的癌基因表达。抑制癌基因及相关基因的表达将改变肿瘤的表型,终止其恶性行为。基因失活主要应用反义基因治疗,反义基因治疗策略包括三种形式:反义核酸技术、核酶和三联体DNA。

反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达,使之低表达或不表达,这种技术即为反义核酸技术,其中包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。

反义RNA和反义DNA

反义RNA是指能以碱基配对的形式和特定的mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段,反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子。反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用:①抑制翻译:反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应,阻止核糖体与mRNA结合,另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNase或ribozyme,降解mRNA;②抑制转录:反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex),或与DNA编码区结合,终止正在转录的mRNA链延长。此外,反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰,如5'端加帽、3'端加尾(poly A)、中间剪接和内部碱基甲基化等,并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞质内运输。

反义核酸目前有三种来源:一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN),这是反义核酸最普遍的应用方式,包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类,其中以PSAON应用最广泛。AON设计合成简单,只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可,而对基因的读码框无要求;二是更具有实用价值的人工表达载体,包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体,它是利用基因重组技术将靶基因序列反向插入到载体的启动子和终止子之间,通过转录可源源不断产生反义RNA分子;三是天然存在的反义核酸分子,自然状态的反义RNA片段极不稳定,很难提纯。因此反义技术中用于肿瘤治疗的反义RNA,大多都是人工合成的核苷酸片段或构建的反义RNA表达载体。

人工合成的反义寡核苷酸可以根据基因的特异序列,构建不同种类的反义寡核苷酸,利用人工合成技术合成。反义寡核苷酸与mRNA互补序列结合,封闭特异性基因的表达,抑制从mRNA到蛋白质的翻译过程。这项实验已在动物模型研究中得到证实。有作者发现头颈部鳞状细胞癌过度表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR) mRNA和蛋白,而EGFR蛋白质对维持鳞状细胞癌增生是必需的。在将头颈部鳞状细胞癌异体移植到裸鼠皮下后,通过合成EGFR的反义质粒进入动物模型,反义寡核苷酸在U6RNA启动子的控制下进行表达。随后观察发现,肿瘤生长受到明显抑制,凋亡率增加。因此认为反义寡核苷酸的基因治疗途径可以干扰EGFR的表达,用于治疗EGFR过度表达的肿瘤,包括头颈部鳞状细胞癌。

反义RNA表达载体是将表达抗肿瘤基因反义RNA的基因导入肿瘤细胞中,使反义RNA能够在肿瘤细胞中与靶mRNA结合,在激活的内源性RNase的作用下,使特定的mRNA遭到分解而被消除。由于反义RNA表达载体是一种持续性的表达载体,因而在肿瘤基因治疗中受到重视。Hamada等采用人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV) 16的E6E7基因的反义RNA重组腺病毒载体(Ad5CMVHPV16As)转染宫颈癌细胞,表达载体中含有巨细胞病毒启动子,具有HPV16感染的肿瘤细胞转染Ad5CMV-HPV16A5表达载体后,生长明显受到抑制。将Ad5CMV-HPV16As转染的肿瘤细胞注射到小鼠体内,不形成肿瘤。因此认为采用腺病毒反义RNA治疗宫颈癌是一种具有潜在能力的新途径。此外,现已采用K-ras癌基因的反义RNA研究肺小细胞癌的基因治疗,采用c-myc癌基因的反义RNA表达载体研究食管癌的基因治疗。在唾液腺上皮性肿瘤中,c-mycH-ras癌基因均有突变,反义技术也为唾液腺肿瘤的基因治疗提供了一个新方法。

王旭等利用反义脱氧寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucletide,ASODN)技术,针对survivin基因设计合成的反义寡核苷酸片段,脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染ACC-M细胞,通过RT-PCR,Westernblotting检测survivin表达的改变,MTT测定细胞增殖抑制,流式细胞术测定细胞凋亡率。结果:转染ASODN组survivin表达下降,细胞凋亡率明显提高,细胞增殖明显受抑制,且与浓度有一定依赖性;ASODN组、空白组与对照组无明显差异。表明survivin ASODN能下调ACC-M细胞系中survivin的表达,在促进凋亡,抑制增殖中发挥重要作用。

核酶(ribozymes)

核酶是一种具有酶活性的RNA分子。它可特异地与靶mRNA结合并使其在特定部位断裂。由于它自身具有很高活性的催化作用,一分子核酶能与多分子的靶mRNA结合。核酶与靶mRNA结合后只催化靶mRNA断裂,自身并不被消耗,因此它反义RNA更高的效率。在肿瘤的基因治疗中,核酶发挥着重要的作用。

核酶广泛存在于生物细胞中,有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区共三部分组成。两个臂序列高度保守,与靶RNA特异互补结合,相当于一种反义RNA,而功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA,而核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成,裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体(X:C、U、A)下游方向即3'端。

核酶除天然存在外,也可人工合成。根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列,可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外,利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游,通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNA分子,使阻断基因表达,特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶mRNA中GUX三联体的位置,可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置,这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能:一方面具有反义抑制作用,另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景,第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准,核酶作为一种遗传信息药物,在肿瘤基因治疗中必将日益受到重视。

c-erbB-2 mRNA的核酶具有高效的酶切活性,能够识别c-erbB-2 mRNA(Rz631) +631到+633位点中的GUC序列并能特异地催化其断裂。将抗bcl-2 mRNA的核酶转染含有c-erbB-2癌基因的卵巢癌细胞,发现该细胞生长受到明显抑制。另一项研究发现,bcl-2癌基因蛋白抑制凋亡,促进肿瘤发生。将抗bcl-2 mRNA核酶转染培养中的前列腺癌细胞株(LNCAP),转染18小时后发现被转染的LNCAP细胞株降低了bcl-2 mRNA水平和蛋白表达水平。在bcl-2低表达的LNCAP的细胞株中出现明显的凋亡现象。此外,一种抗p53核酶能剪切p53前mRNA,可以有效地降低内源性突变型p53 mRNA水平。在含有突变型p53基因的人体H226BR肺癌细胞株内,采用反转录病毒作载体,利用抗p53 RNA的核酶(RZ5a)能特异地剪切p53基因中接近第5内含子和第6外显子的187号密码子,从而降低突变型p53 RNA和蛋白水平。体外实验表明,由核酶催化剪切的是p53基因的人体细胞的生长。因此认为抗p53前mRNA,而不是p53 mRNA。核酶催化剪切的正是p53基因突变的区域,所以核酶剪切的p53前mRNA具有很高的特异性。RZ5a核酶的表达能特异性抑制H226BR细胞生长。因此认为抗p53前mRNA核酶可能在癌基因治疗中发挥作用。

三联体(triple-standed DNA)

三联体能与靶基因特异地结合,阻止RNA转录,抑制在特定位点上的基因表达。三联DNA的抑制是在转录水平上。这种抑制可用于恶性肿瘤的基因治疗,但目前尚未见报道。

RNA干扰技术在唾液腺肿瘤治疗中的应用

RNA干扰技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA(doublestranded RNA,dsRNA)引发的、序列特异性基因转录后的沉默过程。RNAi技术自1998年由Fire等在Nature上报道至今,已经在生命科学领域掀起了一场真正的革命,彻底改变了这个领域的研究步伐。1998年,安德鲁•法厄(Andrew Z. Fire)等在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中进行反义RNA抑制实验时发现,作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果。从与靶mRNA的分子量比考虑,加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1∶1配对时的抑制效果,因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。RNAi技术已成为大多数学者沉默特定基因的首选方法,并取得了满意的基因沉默效果。Science于2001、2002年连续两年将RNAi列为当年科学十大突破之一,RNAi已成为生命科学研究的重要工具。已经迅速而广泛地应用到基因功能、基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因治疗开辟了新的途径。

RNAi引起的靶mRNA的降解是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程,属于基因转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),且需要依赖ATP的参与;大致分为四个阶段进行:①siRNA (small interfering RNA,siRNA)形成;②RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced siliencing complex,RISC)的形成;③效应阶段;④扩增阶段。

RNAi作用的特点:①RNAi是dsRNA介导的转录后基因沉默机制;②高度特异性;③高效性;④可传递性和可遗传性;⑤RNAi有浓度、时间双重依赖性;⑥稳定性;⑦RNAi依赖ATP的参与。

除siRNA之外,微小RNA(microRNA,miRNA)也可以引起基因沉默,miRNA是生物体内源长度约为20~23个核苷酸的非编码小RNA,通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止,已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中,进化上高度保守。

小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)作为两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是RNAi技术最主要组成部分。近年来,小干扰RNA作为一种肿瘤治疗方法已被引入实验性研究,并作为以核酸为基础的医学被开发。二者的区别在于:miRNA是内源的单链RNA,是生物体的固有因子。而siRNA是人工体外合成的双链RNA,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物;miRNA可抑制靶标基因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达,而siRNA不参与生物生长,是RNAi技术应用的产物。

RNA干扰技术在唾液腺肿瘤治疗中的应用

近年RNA技术在唾液腺肿瘤的研究中也得到了广泛的应用。Pramoonjago采用RNA沉默技术敲减人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-3过表达的Sox4基因,基因沉默后ACC-3细胞的生存能力下降了51%,细胞凋亡达到85%。

针对化疗药物在治疗头颈部肿瘤应用效果不理想的临床实际问题,Uchihash采用针对多药耐药蛋白-MRP7(multidrug resistance protein,MRP7)的RNAi,作用于抗长春新碱的人唾液腺腺癌(SGA)和鳞癌(SCC),排除了SGA细胞对药物多喜紫杉醇(docetaxel)的敏感,证明人唾液腺腺癌中MRP7的表达与抗药性有关。

王洁课题组应用RNAi技术在唾液腺肿瘤治疗实验研究方面取得一定成果,如构建靶向人木糖基转移酶-Ⅰ(xylosyltransferase-Ⅰ,XT-Ⅰ)基因的短发卡状RNA(shorthairpin RNA,shRNA)真核表达载体shRNA-WJ3、shRNA-WJ4,转染人唾液腺腺样囊性癌高转移细胞系ACC-M细胞,通过G418筛选稳定转染的细胞,基因转染后经基因水平及蛋白水平细胞鉴定,RNAi技术能够有效沉默ACC-M细胞XT-Ⅰ基因的表达,基因沉默后ACC-M细胞增殖、侵袭及远处转移能力显著下降。同时经脂质体介导shRNA-WJ4转染腺样囊性癌细胞系SACC-83细胞,有效沉默SACC-83细胞XT-Ⅰ基因的表达,并通过体内嗜神经侵袭实验证实,XT-Ⅰ基因沉默后SACC-83细胞的嗜神经侵袭能力明显下降。

构建H-ras靶向H-ras-shRNA质粒,经脂质体介导转染SACC-M细胞,经鉴定显示H-ras-shRNA质粒能有效降低SACC-M细胞中H-ras表达,H-ras基因抑制率为61. 80%,H-ras蛋白表达抑制率为62. 76%。细胞增殖活性明显受抑,G0/G1期比例增加,H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低。表明H-ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC-M细胞中H-ras基因及蛋白水平的表达,降低细胞体内外的增殖活性,并能有效诱导细胞凋亡。

同时,RNAi技术在抑制唾液腺肿瘤其他基因,如Sox4c-erbB2p53等基因治疗方面也取得一定进展。

目前,随着基因治疗在唾液腺肿瘤治疗方面的研究不断深入,在唾液腺肿瘤基因治疗的研究中,相对比较成熟的是p53基因治疗。由于人类唾液腺肿瘤普遍存在p53基因变异,因此p53基因治疗认为是提高治疗效果很有希望的方法。WT-p53基因具有调节细胞周期和抑制肿瘤细胞生长的功能,这是人们早期将WT-p53基因重组腺病毒载体用于肿瘤基因治疗的理论依据。实验结果显示,复制缺陷型腺病毒载体(cyto-megalovirus adenoviral vector,Ad-CMV) -p53导入后,bax基因和p53基因的下游作用基因均有高表达。他们共同作用于肿瘤细胞,使细胞停止在G1期,促进细胞凋亡。另有研究证明,Ad-CMV-p53联合肿瘤化疗药物对肿瘤细胞抑制更明显,这是因为Ad-CMV-p53能降低化疗药物的有效药物浓度并增加了肿瘤化疗药物的细胞毒性,加上由p53基因诱导所产生的对细胞周期调节的作用,可有效地抑制肿瘤细胞生长。Airoldi等指出,由于新治疗药物的出现,目前以p53基因为靶点的药物治疗已具有可行性,这些药物可与放疗和化疗联合应用治疗进展性及转移性唾液腺恶性肿瘤。另一方面,Asaumi等实验证实,联合应用透热X射线疗法和p53基因治疗唾液腺腺癌,其效果优于单独应用者。Croci等尝试采用人类表皮生长因子受体(human epithelial growth factor receptor,HEGFR) HER-2,和WT-p53基因疫苗注射唾液腺肿瘤裸鼠模型,被注射裸鼠体内所表达的HER-2及白细胞介素-12可有效预防肿瘤发生。肿瘤的预防由细胞来源的细胞因子及HER-2抗体所介导,因此认为高效疫苗所诱导的免疫反应可有效阻止不同靶组织肿瘤的发生。

肿瘤的发生是癌基因的激活与抑癌基因的失活所造成的,在唾液腺肿瘤治疗中,阻断癌基因的表达或向肿瘤细胞内添加抑癌基因则有可能逆转肿瘤的恶性表型。p53基因作为一个肿瘤抑制基因,在正常细胞代谢及多种肿瘤的发生、发展中起着重要作用。由于对p53基因的结构和生化功能的认识还不充分,对其他抑癌基因的协同作用机制尚未明了,因此这方面的研究方兴未艾。随着研究方法的不断改进和研究资料的不断积累,p53基因将会逐渐被人们深入认识,并对唾液腺肿瘤的药物研究和临床治疗产生积极的影响。

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