血管新生的调控因子及其机制

血管新生是个复杂的过程,涉及多方面的因素。正确认识血管新生的调节机制是解决血管新生相关疾病的基础,也是目前研究的焦点。

Hanahan等提出的肿瘤血管新生的平衡学说系统阐述了血管新生调控机制:正常情况下,血管新生的诱导剂和抑制剂处于平衡状态,维持血管系统的正常生长。一旦平衡状态被打破,或者激活静息的血管系统,发芽长出新的微血管;或者使血管处于持久的关闭状态。此假说为肿瘤的发生、转移以及治疗提供了理论依据。它的提出是基于以下三个实验结果。第一,体外研究表明,bFGF和VEGF能够抑制内皮细胞的增生和迁移反应,若同时给予血小板敏感蛋白(TSP),以上反应将被抑制。第二,Dameron等为了检测p53肿瘤抑制基因的丢失对血管新生的影响,培养Li- Fraumeni病人的成纤维细胞。该个体分别遗传了一个野生型和突变型的p53基因,最后发展为肿瘤。在早期传代的Li- Fraumeni成纤维细胞是二倍体,各有一个突变和野生的等位基因,培养的细胞分泌大量的TSP进入基质;在晚期,传代细胞变为非整倍体,仅保留突变型p53等位基因,细胞分泌的TSP减少,其mRNA水平下降92. 8%~94%。体外实验结果表明,Li- Fraumeni成纤维细胞的基质丧失了抑制肿瘤或bFGF所诱导的血管新生。

第三,bFGF、VEGF构成性地表达在正常或转基因小鼠RIP1- Tag2的胰岛细胞。在RIP1-Tag2小鼠的病理过程中,发生包括增生期、血管形成早期、血管形成期、肿瘤期几个阶段,而在正常小鼠的胰岛中却不存在血管新生的表型,很可能血管新生抑制剂维持着血管新生的关闭状态。一旦抑制剂的作用消失,则平衡发生改变,启动肿瘤形成过程中的血管新生表型。动物实验结果支持上述假说。联合使用血管新生抑制剂(AMG- 140、四环素、IFN)能够显著抑制转基因小鼠(RIP1- Tag2)的肿瘤进展,治疗组与对照组相比,肿瘤体积和血管密度是对照组的10%和40%。但是,以上三种血管新生抑制剂对肿瘤血管新生表型的阻断作用是不完全的。如何组合血管新生抑制剂,使得原发肿瘤处于“静息”状态,是需要进一步解决的问题。

可以看出,血管新生相关的刺激和抑制因子共同调控血管形成的过程,通过促血管生成因子与抑制血管生成因子作用的相互平衡,将血管新生维持在正常生理范围。迄今为止,已知的促血管新生因子包括:VEGF、bFGF、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管生成素1,2(Ang- 1、Ang- 2)、血小板衍生生长因子- BB(PDGF- BB)、转化生长因子-β(TGF-β)、红细胞生成素(EPO)、表皮生长因子(EGF)、干细胞生长因子(HGF)、白细胞介素(IL)-6等。常见的血管新生抑制剂有:TSP- 1、血小板第4因子(PF4)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、内皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、甲氧明(vasostatin)、IL- 12、干扰素(IFN)-γ及α、杀菌性/渗透性增高蛋白(BPI)、AMG- 140、四环素等。本章选择主要的促血管新生因子和血管新生抑制剂介绍如下。

VEGF

VEGF是最常见的强力促血管新生因子,又称为血管通透因子(VPF),是1986年Senger等从癌性腹水和癌细胞培养介质中纯化到的分子量为34~42kDa的热、酸稳定分子,常与肝素结合,是由二硫键连接的糖蛋白二聚体。现知共有四种VEGF的cDNA克隆,分别编码121、165、189和206个氨基酸多肽,其中VEGF- 121和VEGF- 165属于分泌型蛋白质,与VEGF的生物学特性密切相关。

Namiki等首先提出VEGF介导了低氧所致的血管新生。在完全低氧的情况下,VEGF的水平是原来的13倍。低氧条件改善,VEGF mRNA水平能够可逆地下降。现已明确,VEGF基因启动子的5'端由28个氨基酸组成的序列介导低氧所诱导的转录。另外,低氧增加mRNA的稳定性是重要的转录后调节机制,介导这一特性与VEGF mRNA的3'端非翻译区有关。低氧介导VEGF表达的信号传递是近年来人们所关注的问题。Mukhopadhyay等发现蛋白质酪氨酸激酶抑制剂5,4,3'-三羟异黄酮,能够降低低氧所诱导的VEGF mRNA的表达,在浓度为360μmol/L时,VEGF mRNA降至基线水平。使用抗磷酸化酪氨酸-416- src抗体和c- src单抗进行蛋白质印迹分析,在低氧超过60分钟时,srcY416的磷酸化增加,提示低氧增加了src的催化活性以及src自身磷酸化位点的酪氨酸磷酸化。为了研究src活化和VEGF mRNA的相互关系,通过表达c- src的质粒转染U87和293细胞,分别检测处于低氧和非低氧状态下VEGF mRNA水平。发现在低氧状态下c- src的过表达增加了VEGF的转录;而非低氧状态时,VEGF的水平无显著增加。以上结果提示,低氧诱导的VEGF mRNA增加是通过c- src的活化而实现的。

VEGF作为血管新生最主要的调节因子之一,一方面可以通过穿孔及囊状-空泡细胞器等作用,介导血管通透性增高,使血浆蛋白质外渗;另一方面,又具有促进内皮及其前体细胞活化、增生及迁移的作用。目前已知的VEGF受体有3种:Flt- 1 (VEGFR- 1)、KDR(VEGFR- 2,在鼠类又称Flk- 1)、Flt-4(VEGFR- 3),均属于受体酪氨酸激酶。KDR是内皮细胞和血细胞生成过程中最早的共同表面标记,它的缺失可导致胚胎内皮及造血细胞系列缺失,证实体内存在内皮及造血细胞的共同前体细胞(haemangioblast)。VEGF可通过活化KDR诱导血管干细胞的分化,促进内皮细胞增殖。而活化Flt- 1则可调节内皮细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用,促进血管的成熟及稳定。Flt-4主要调节前两种受体的作用及淋巴管的生成。VEGF在实体瘤及血液系统疾病中的作用已得到广泛的研究及认可,许多肿瘤细胞包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、白血病细胞等均可表达VEGF mRNA及蛋白质,与肿瘤的恶性进展有关,阻断KDR信号途径也可导致肿瘤生长及转移的抑制。

bFGF

FGF是一种结构相关的多肽,至少有17种,其中bFGF是研究最多、生物效应最强、作用最广泛的成纤维细胞生长因子之一。bFGF是一个18kD的多肽,由155个氨基酸残基组成,其独特的结构特征为无信号肽。bFGF有4种:18kD或低分子量的bFGF,22kD、22. 5kD、24kD的高分子量bFGF。不同的bFGF与不同的细胞功能有关。低分子量的bFGF由细胞分泌出来,刺激细胞迁移、增殖,通过结合到表面受体刺激bFGF受体下调。bFGF位于细胞核,并调节细胞增殖。由于高分子量bFGF缺乏经典分泌途径所需的信号肽,通过何种机制分泌到细胞外仍不清楚。一般bFGF发现于细胞外,并以自分泌形式调节多种细胞功能。多种肿瘤细胞和内皮细胞都有bFGF受体的表达。bFGF是通过4个高亲和力酪氨酸激酶受体和细胞表面肝素硫酸化蛋白聚糖组成的双受体系统发挥生物活性的。

体内、外研究表明,FGF有促进血管内皮细胞增殖、迁移;促进蛋白激酶释放以降解基底膜、促进内皮细胞形成管腔的作用;同时也可以通过PDGF间接促进平滑肌细胞增殖。在心肌缺血的模型中,bFGF浓度上升和特异性受体的上调可促进血管新生和侧支循环的建立。bFGF相对VEGF来说没有内皮细胞作用特异性。bFGF受体可在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、成肌细胞和肿瘤细胞等多种细胞表达。而为什么bFGF诱导肿瘤血管新生时以显著的内皮细胞增生为特点,而平滑肌细胞和成纤维细胞增生不明显仍是个疑问。此外,bFGF受体是否在体内微血管内皮上表达还不清楚。

血管生成素

Davis等从人SHEPH1- 1和鼠C2C12ras细胞克隆了TGF-β抑制元件2(TIE2)配基APO- 1,其cDNA克隆的DNA序列是编码498个氨基酸的阅读框架,两者存在97. 6%同源性。APO- 1 是70kD的糖蛋白,能够特异性地结合TIE2,隔离常数(Kd)是3. 7nmol/L。有趣的是,APO- 1不能诱导内皮细胞的生长反应,在胚胎9~11天,APO- 1主要定位于心内膜周围,以后分布在血管的间质。为了阐明APO- 1的生理作用,Surl等通过基因敲除(Knockout)方法构建了缺乏APO- 1表达的小鼠,在胚胎形成第11天表现出异常。其中,最显著的缺陷是心内膜以及心肌的发育异常,TIE2mRNA水平降低,而其内皮细胞的数量与正常胚胎近似。由此可见,APO- 1/TIE2系统在心脏发生早期和血管新生的过程中具有重要的作用。APO- 1缺陷胚胎与正常胚胎血管超微结构的主要区别在血管组织皱襞,正常胚胎血管内皮细胞呈薄的扁平状,与外周内皮细胞(periendothelial cell)、胶原样的纤维丝结合在一起;APO- 1缺陷小鼠血管表现为缺乏外周内皮细胞,纤维丝孤立存在,而且呈散在的排列。组织皱襞在血管的分支、重建、外周细胞的趋化、基质成分的构成过程中有着重要的作用。所以,从APO- 1缺陷胚胎的异常表现可以看出,APO- 1参与了构建血管非内皮细胞的部分,使得血管结构得以完整。

APO- 1/TIE2系统在血管形成过程中的作用机制尚不完全清楚。Vikkula等提出了“环路-耦联”假说,所谓的环路就是指内皮细胞表达的TIE2和平滑肌细胞表达的APO- 1形成反馈环路,内皮细胞的激活信号对APO- 1的表达起到负调节作用,“TIE2-配基”环路与PDGF和TGF-β介导的血管平滑肌细胞的趋化、增生、分化相耦联;若两者失耦联,则导致血管形成不良。Folkman等在此基础上补充提出了“间质细胞的趋化模式”:间质细胞释放的APO- 1与受体TIE2结合后,内皮细胞产生趋化局部间质细胞形成血管的信号(即PDGF和EGF)。当两个细胞相互接触,TGF-β被活化,进而诱导间质细胞分化为周细胞和平滑肌细胞,抑制内皮细胞的增生和刺激基质沉积。

TSP

TSP是最早发现的生理性的血管新生抑制剂之一。TSP可以抑制内皮细胞的增殖、迁移以及组建毛细血管的过程。子宫内膜是研究血管新生较好的模型。TSP主要表达在子宫内膜的上2/ 3,分布在腺体、小血管、毛细血管的基底层。在子宫内膜分泌期TSP mRNA的水平是增生期的3. 5~4. 2倍。另外,TSP mRNA水平与黄体酮的剂量、作用时间有关,其最大的诱导作用在10~25μmol/L,与内皮细胞作用6~8小时后TSP mRNA水平最高,是对照组的4. 2倍,而作用24小时后TSP的水平低于对照组。以上结果表明,黄体酮对TSP的调控是双向的,开始表现为刺激,随后出现抑制作用。到目前为止,已知存在5种不同类型的TSP蛋白,仅有TSP- 1 和TSP- 2具有影响血管新生的功能区,其中TSP- 1 受p53的调控。TSP- 1和TSP- 2结构和功能方面具有同源性。TSP- 1和TSP- 2缺失的小鼠体内血管新生明显增强;相反,肿瘤细胞过度表达TSP- 1和TSP- 2则降低肿瘤血管新生,抑制肿瘤生长。

内皮抑素(endostatin)

1997年,O’Reilly等分离和纯化一种20~22kDa的血管新生抑制剂-内皮抑素。它可以抑制内皮细胞增殖和迁移,诱导内皮细胞凋亡,使其停留在G1期。内皮抑素通过抑制MMP- 2活性,阻断VEGF165和VEGF121结合VEGFR- 2,并能稳定细胞间和细胞与细胞基质间的黏附。肿瘤细胞过度表达内皮抑素还可以抑制肿瘤生长和转移。目前发现,重组的可溶性内皮抑素可以抑制20多种小鼠肿瘤细胞生长。内皮抑素可以和VEGF或FGF- 2上调的所有促血管新生因子相互作用,并且可以下调内皮细胞Jun B、缺氧诱导因子(HIF- 1α)、neuropilin及表皮生长因子受体。然而,在临床应用中,内皮抑素只是对部分肿瘤患者有效。

血管抑素(angiostatin)

O’Reilly从肿瘤动物模型的血清和尿中成功分离和纯化了另外一种血管新生抑制剂,与纤溶酶原具有相类似结构、分子量为38kDa的内部片段,命名为血管抑素。它特异性地抑制生长期的内皮细胞增殖,但对静息期融合的内皮细胞及其他类型的细胞(如平滑肌细胞、表皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞)没有显著作用。不过,血管抑素对原位肿瘤的生长抑制显著,可以达到98%;还可诱使巨大肿瘤体积缩小。

血小板第4因子(PF4)

PF4是第一个用于检测抗血管新生活性的因子。PF4是血小板特异性蛋白,在巨核细胞中合成,在α-颗粒中包装,于血小板黏附、聚集等活化状态时以相对高分子量蛋白多糖- PF4复合物的形式从血小板中释放。它具有与鱼精蛋白相类似的结合和中和肝素的作用,同时参与造血调控,特异性抑制内皮细胞增殖和迁移。PF4抑制内皮细胞的活性与其羧基端的区域有关。局部注射PF4可以显著抑制结肠癌的生长,尽管在体外实验中未显示明显的抑制肿瘤细胞生长作用,但能够明显抑制内皮细胞的增生和迁移。

生理条件下,机体内存在大量的内源性的血管新生抑制剂,与促血管新生因子相互作用,调控着血管新生的过程。目前,对于这种相互作用的机制尚不完全清楚。而许多疾病如肿瘤、RA、糖尿病视网膜病变的严重程度与过度血管新生密切相关。因此,内、外源性血管新生抑制物质可望成为这些疾病的新的治疗手段。例如,PF4能够抑制肿瘤的生长,体外实验表明PF4能够抑制内皮细胞的增生、迁移。PF4是如何发挥血管新生抑制的作用呢?我们对PF4和bFGF的相互作用进行了探索,发现PF4能够与bFGF形成复合物,通过抑制bFGF二聚体形成、抑制与bFGF受体结合、抑制bFGF的内化等几方面与bFGF相互作用,PF4很可能通过这种作用机制发挥抗血管新生的特性。另外,外源性的血管新生抑制剂如沙利度胺、雷利度胺等已广泛应用于许多血液系统疾病及肿瘤性疾病的抗血管新生治疗,取得了显著疗效。

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