血液乳酸的测定:酶促分光光度法

原理

利用乳酸脱氢酶(LDH)将乳酸生成丙酮酸,氧化型辅酶Ⅰ(NAD)接受H而被还原成还原型辅酶Ⅰ(NADH)。在340nm波长处测定NADH的吸光度,从而计算出样本中的乳酸含量。

乳酸含量计算

在反应体系中,LDH催化的反应是可逆反应,所以在缓冲液中需要加入肼类化合物与丙酮酸生成稳定复合物,使反应顺方向进行。在340nm波长处测定NADH的吸光度,从而计算样品中的乳酸浓度。

试剂

  1. 0.079mol/L Tris缓冲液(pH 9. 6)称取三羟基甲基氨基甲烷(Tris)9. 75g溶于约500ml蒸馏水中,加入水合肼22. 87ml,乙二胺四乙酸二钠1. 85g,1mol/L盐酸10ml,再加蒸馏水至950ml左右,调整pH 9. 6,最后补加蒸馏水到1000ml。
  2. 0.6mol/L高氯酸溶液(HClO4相对密度1. 67,67%)取10. 4ml高氯酸加入蒸馏水至200ml。
  3. 0.027mol/L氧化型辅酶Ⅰ(NAD)溶液,称取18mg NAD,加入蒸馏水1ml,在冰箱保存一个星期。
  4. 乳酸脱氢酶(LDH)溶液,以3. 2mol/L硫酸铵溶液将乳酸脱氢酶稀释成550U/ml的LDH溶液。
  5. L-乳酸标准储存液(11. 11mmol/L),称取L-乳酸锂0. 1066g溶于蒸馏水10ml,加入浓硫酸25μl,移入100ml容量瓶,以蒸馏水加至刻度处。置于冰箱保存,将贮存溶液5倍稀释后作为标准工作液(2. 22mmol/L)。
  6. 3.2mol/L硫酸铵溶液,称取42. 27g硫酸铵溶解于蒸馏水中,然后加入蒸馏水至100ml。

操作方法

一、全血测定法:制备无蛋白滤液:于小试管中加入0. 6mol/L HClO4溶液0. 2ml,取耳垂血0. 1ml加入并混匀,放置5分钟后,以3000转/分离心5分钟,取上清液按下表进行测定。

全血乳酸测定法

全血乳酸测定法

混匀,在37℃水浴中保温20分钟后在340nm波长处读取各管的吸光度值(A)。

计算:测定管(A)-空白管(A)=A

乳酸计算

正常范围:1~1. 78mmol/L

二、血浆测定法:取血液2ml在含有抗凝防腐剂0. 1ml的干燥试剂中,混匀并及时分离血浆,1小时内进行测定(下表)。

血浆乳酸测定法

血浆乳酸测定法

抗凝防腐剂:肝素200mg,氟化钠10g溶于蒸馏水中,然后稀释至100ml。此溶液0. 1ml加入试剂管中,60℃干燥后备用,可抗凝防腐2ml血液。混匀后,37℃水浴保温20分钟,340nm波长处以蒸馏水调零点,读取各管的吸光度值(A)。

计算:测定管(A)-空白管(A)=A

乳酸计算公式

正常范围:1. 2~2. 0mmol/L

试验方法评价

一、反应时间及稳定性:使用2. 78mmol/L、 5. 56mmol/L乳酸,试验观察其反应时间及稳定性。在37℃保温20分钟其反应便达到终点,然后最少能稳定至1小时,结果见下表。

实验反应时间及稳定性观察

实验反应时间及稳定性观察

二、试验线性范围:乳酸浓度0. 56~13. 33mmol/L,试验呈线性,相关系数(r)为0. 999。如样品结果大于13. 33mmol/L时,可稀释后再进行测定。结果乘以稀释倍数。

三、回收试验:本法回收试验良好。在已知样品中加入1. 11~11. 11mmol/L乳酸,平均回收率为100. 8%,其结果见下表。

乳酸回收试验

乳酸回收试验

四、试验结果的精密度和准确度:采取试验重复性计算试验变异系数来衡量试验的精密度;配制各种浓度的L-乳酸标准液来进行测定,其测得结果与实际标准浓度的相关(表10-5)与宝灵曼试剂盒作对比试验来评定测定结果的准确度,其结果如下。

乳酸标准浓度预测出浓度的比较

乳酸标准浓度预测出浓度的比较

批内变异:乳酸:1. 53mmol/L,变异(CV):2. 7%;乳酸:8. 18mmol/L,变异(CV):1. 3%。日间变异:乳酸:1. 53mmol/L,变异(CV):5. 6%;乳酸:8. 18mmol/L,变异(CV):2. 7%。

测出的结果和实际浓度的结果是一致的,都有极好的相关性。相关系数为0. 999,乳酸标准浓度为x,回归方程为:y=0. 99x+0. 02。

全血测定方法与宝灵曼试剂盒(Boehringer CAT,NO. 124842)的比较,共测定50例样品,r:0. 997,本法为x,回归方程:y=1. 02x -0. 02。

血浆测定法与宝灵曼的全酶法试剂盒(Boehringer CAT,NO. 149993)同时测定50例样品,r:0. 999,本法(血浆)为x,回归方程:y=1. 03x+0. 05。

从上述结果看本方法测定的结果的精密度和准确度都均为良好,本法操作又比较简单,便于在临床上推广使用。

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/6576.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学