D-3-羟丁酸测定(血清)

D-3-羟丁酸的测定方法有:酸氧化比色法、气相色谱法、酶法和毛细血管等速电泳法。早年的酸氧化比色法,操作费时且缺乏特异性。近期发展的气相色谱法是测定D-3-羟丁酸在氧化反应过程中生成的丙酮,特异性高,且只需少量样品,但操作费时,且需要作内源性丙酮的校正。新近推出的等速电泳法,快速、直接而敏感,但需要价格昂贵的仪器设备,另外如果pH控制不严,会带来较大的误差。

酶法灵敏度高,速度快,样品用量少,不需要提纯或预处理便可直接测定,适用于各种型号的生化自动分析仪。

反应原理:D-3-羟丁酸被3-羟丁酸脱氢酶催化脱氢,氧化生成乙酰乙酸,同时使NAD还原成NADH;NADH在340nm波长有最大吸收峰,NADH生成速率与血清D-3-羟丁酸的浓度成正比。

D-3-羟丁酸被3-羟丁酸脱氢酶催化脱氢,氧化生成乙酰乙酸,同时使NAD还原成NADH;NADH在340nm波长有最大吸收峰,NADH生成速率与血清D-3-羟丁酸的浓度成正比

试剂

1. 缓冲液:

  1. Tris缓冲液0. 1mol/L
  2. EDT:A2mmol/L
  3. 草酸:20mmol/L

2. 酶及辅酶:3-羟基丁酸脱氢酶:0. 6U/10ml、NAD 2. 5mmol/L

3. D-3-羟丁酸标准储存液(20mmol/L),溶解307mg D-3-羟丁酸(钠盐)于50ml H2O蒸馏水中,在4℃冰箱中保存,标准液(2mmol/L):以上述缓冲液10倍稀释。

在试验时,用试剂1缓冲液10ml溶解试剂2时,在室温下可稳定1天。

操作步骤:

 

混匀,37℃保温半分钟后,在340nm波长以空白管调零,读取各管第一次吸光度。然后每隔1分钟读取1次,连续测定3分钟,求出各管平均每分钟的吸光度度数(△A)。计算:

D-3-羟丁酸

参考区间:健康成年人血清D-3-羟丁酸为0. 03~0. 30mmol/L。

附注

  1. D-3-羟丁酸测定已有市售试剂盒供应,应选用有批准文号的优质试剂,此法适用于各种型号的生化自动分析仪,应严格按照说明书及试剂盒指令进行操作。
  2. 建议每个实验室建立自己的参考范围,以反映年龄、性别、饮食以及地理环境的差别。
  3. 本法线性范围在0. 1~3. 2mmol/L,若标本浓度超过3. 2mmol/L浓度,应用生理盐水稀释血清,结果乘以稀释倍数。
  4. 试剂中含有草酸,可以抑制乳酸脱氢酶对血清中乳酸的氧化反应。
  5. 试剂中含有防腐剂NaN3,不可用口吸,不要接触皮肤和黏膜。处理试验的废液,应遵照处理NaN3的规定进行。
  6. 每天都要做室内质控,最好作两个水平的质控,所得数值应落在指定范围内。
  7. Hb达10g/L、乙酰乙酸达2. 5mmol/L,胆红素达160μmol/L对本法不产生干扰,TG>12mmol/L可使D-3-羟丁酸轻度增高。

临床意义:脂肪酸代谢形成少量的乙酰乙酸,随后在周围组织中被代谢。在碳水化合物丧失(即饥饿)或碳水化合物利用减低(即糖尿病)的情况下,乙酰乙酸的产生增加,其存在量可能超过周围组织对乙酰乙酸的代谢能力。因此,乙酰乙酸在血中积聚,通过自发的脱羧反应,有少部分转变成丙酮,而大部分在肝中转变成D-3-羟丁酸。

乙酰乙酸,D-3-羟丁酸和丙酮这三种总称酮体,在血中的相对比例可能有变化,一般情况下78%为D-3-羟丁酸,20%为乙酰乙酸和2%为丙酮。测定血清或尿中酮体的常用方法中,没有一个方法能和这三种酮体同时反应。

糖尿病患者酮酸中毒时,葡萄糖的氧化作用遭受损害,酮体的生成加速,而利用降低。D-3-羟丁酸的测定,对酮酸中毒的鉴别诊断和监护很有帮助。D-3-羟丁酸检查的重要性在于酮酸中毒使体内NADH生成增加,进而使乙酰乙酸形成D-3-羟丁酸。在严重中毒患者,代谢中的D-3-羟丁酸与乙酰乙酸的比值可从正常人的2∶1提高到16∶1;监测糖尿病酮酸中毒时,血清或尿中的乙酰乙酸浓度可能造成误解。在酮酸中毒的早期阶段,D-3-羟丁酸/乙酰乙酸可达到它的最高点。而继续治疗,该比值将随着D-3-羟丁酸被氧化成乙酰乙酸而有降低。当只有检测乙酰乙酸时,医师常可发现在患者的病情改善时,乙酰乙酸反而增加。因此,只有通过跟踪D-3-羟丁酸才能得到酮症的比较真实的情况。应当指出,即便临床病情已经改善,也不应该放松监护。

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