抗血管新生基因治疗实体肿瘤

目前,恶性肿瘤的治疗主要依赖于外科手术及放/化疗,以尽可能清除残余的癌细胞。这种“直接攻击”的治疗手段仍不尽人意,相当一部分病人因微小残留病灶和转移灶存在而复发。在过去的20多年里,肿瘤病人的总生存率并无明显改变,因此开发高效、低毒的新治疗方法势在必行。近年来,血管新生和血管生长因子在恶性肿瘤中的作用日益受到重视,迄今已有近20种血管新生抑制剂进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。

靶向性抗血管新生基因治疗实体肿瘤策略的基础

20世纪70年代,Folkman就提出,肿瘤组织的血液供应是实体肿瘤生长所必需的,当肿瘤生长超过1~2mm2时,瘤体的增长就有赖于新生的血管供给营养。因此提出,减少瘤体血液供应可以成为治疗肿瘤的一种方法。肿瘤侵袭、转移是一个复杂的过程:原发肿瘤细胞增殖、肿瘤血管新生、消化基底膜、肿瘤细胞穿入血管或淋巴管形成瘤栓并转运到远端的器官、穿出血管并形成微小转移灶、转移灶肿瘤血管新生、转移灶细胞增殖。由此可见,血管新生在肿瘤的发生、侵袭转移的过程中均发挥着重要作用。临床上,肿瘤侵袭、转移即意味着丧失了治疗的希望。实验证明,抑制肿瘤的血管新生,减少肿瘤的新生血管密度,减少肿瘤的血液供给,可以明显抑制肿瘤的生长。

肿瘤血管与正常血管之间有着许多形态学差异,肿瘤内部血管多襻和扭曲,易形成动-静脉短路,血管壁孔径增大,形成渗漏,肿瘤血管内皮细胞增殖速度是正常组织内皮细胞的20~2000倍(胎盘组织除外)。

靶向性活化的内皮细胞抑制血管新生有其独特的优势:在生理条件下,正常成年人组织中的血管内皮处于静止状态(女性生殖器官除外),而肿瘤内部血管处于活化、增殖和迁移状态。同时,基因治疗的靶向性可以使抑制血管新生的作用局限于患有肿瘤的器官,从而选择性地抑制肿瘤血管新生,而不影响正常组织生理状态下血管新生。

抗肿瘤的血管新生基因治疗策略

微环境中血管新生刺激因子及抑制因子的平衡是微血管形成与否的关键。因此,抗肿瘤血管新生就成了治疗肿瘤的靶位点。可将血管新生过程中的各个环节作为靶点,改变肿瘤血管新生刺激因子和抑制因子之间的平衡关系,达到治疗目的。抗肿瘤血管新生基因治疗概括为三方面:①抑制血管新生刺激因子的表达;②诱导血管新生抑制因子的表达;③抑制内皮细胞上的受体表达。

增强血管新生的抑制因素:

基于恶性肿瘤是血管新生依赖性疾病的理论,通过增强血管新生抑制因子的局部浓度,抑制肿瘤的血管新生,达到治疗肿瘤的目的。Weinstat- Saslow等用TSP- 1基因表达载体(pCMVBamNeo)转染人乳腺癌细胞系,然后将转染的人乳腺癌细胞注射入裸鼠体内,观察原发肿瘤的生长、转移潜能和血管新生。结果发现,TSP-1抑制了肿瘤的血管新生,肿瘤的发展受到显著的抑制。刘澎等报道,腺病毒介导的TSP- 1抗血管新生衍生物基因转移可明显抑制K562细胞在裸鼠体内生长。Yong报道,阳离子脂质体- DNA复合物介导的p53基因静脉内注射,诱导血管内皮细胞、巨噬内源性TSP- 1的表达,在荷瘤鼠发挥抗肿瘤播散及抗肿瘤血管新生的作用。

Frank发现,用血管抑素转染大鼠C6神经胶质瘤或人MDA- MB- 231乳腺癌细胞系后,移植入胸腺缺陷裸鼠,则可抑制肿瘤内部及边缘的血管新生,表现为血管新生密度减少及肿瘤生长抑制。尿激酶氨基末端片段(ATF)是一新的肿瘤血管新生抑制因子,其分泌型分子能够结合细胞表面的u- PAR,ATF缺少u- PA全长的蛋白水解酶活性。Li等发现,腺病毒载体介导的鼠ATF基因转染,在异种移植和同基因型鼠模型中表现为血管新生依赖性肿瘤生长的抑制作用。还有研究者发现,腺病毒载体及反转录病毒载体介导的分泌型PF4基因转染人神经胶质瘤细胞系等肿瘤细胞后,再移植人裸鼠,结果肿瘤内的血管密度明显减少,肿瘤的生长受到抑制,实验动物生存时间明显延长。

促血管新生信号间的抑制:

通过降低促血管新生介质的表达和干涉促血管新生介质与血管内皮细胞间的信号联系,来抑制血管新生。

一、干涉内皮细胞间信号转导

干涉内皮细胞间信号转导指的是通过阻断促血管新生介质与内皮的联系,达到抑制血管新生的作用。用复制缺陷病毒载体介导的PAI- 1cDNA转染,通过干涉血浆酶原激活剂的功能,降低基底膜的消化,可明显降低肿瘤的转移,延长实验动物的生存时间。IL- 12在抗肿瘤免疫中具有多重生物学功能,如增强Th1细胞反应性和体内血管新生的抑制作用。Popovic等人检测了IL- 12的抗肿瘤转移作用,含有IL- 12转染的自体同源鼠D122细胞的疫苗干扰了细胞间的信号转导,在有免疫活性的同基因型鼠中明显延迟了肿瘤的形成和转移。考虑到VEGF在血管新生中的重要作用,有人设计了含有编码VEGF受体Flt- 1片段的重组腺病毒载体,此片段可以高亲和力结合于VEGF分子和内源性VEGF受体(Flt- 1和Flk- 1/ KDR),形成非活性状态的异源双体受体结构,使VEGF不能启动内皮细胞增殖。

二、促血管新生介质表达的抑制

在抗血管新生的基因治疗中,有几个关键的环节可以作为靶位点。核酶和反义核苷酸技术可以阻止生长因子及其受体的合成。SF/HGF及其受体c- met与血管新生密切相关。SF/HGF在神经胶质瘤中的高表达能够增强肿瘤相关的血管新生。Abounader报道,用U1核内小RNA转染神经胶质瘤细胞,应用SF/HGF反义核苷酸技术均可以抑制SF/HGF基因的表达,在体内可抑制肿瘤的形成和生长。He等建构了靶向性VEGF mRNA 5'端的两个锤头核酶(hammerhead ribozyme),转染神经胶质瘤细胞,导致VEGF转录水平和蛋白水平降低。另外,Ellis等报道,用c- src的反义核苷酸技术转染克隆癌细胞,导致了酪氨酸激酶活性的受阻,从而影响了VEGF活化的途径。还有报道用特异的核酶降低FGF结合蛋白水平以降低FGF- 2的生物学活性。

载体系统

载体系统是基因治疗的重要环节。基因的导入是依靠载体来实现的。载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和一系列非病毒载体。各载体又有其不同的特点。

反转录病毒载体是一含有5'和3'长末端重复序列及结构基因的单链RNA,外源基因可以整合到缺失一个或几个结构基因的反转录病毒载体上。当重组的反转录病毒载体转染靶细胞时,该病毒载体可以整合进入宿主基因组并表达病毒基因和外源基因。反转录病毒载体结构简单,和宿主免疫反应小。但不足的是,重组反转录病毒载体仅整合分裂期细胞并在整合时发生插入突变。

腺病毒载体是一个有蛋白壳包裹的双链DNA。腺病毒载体缺失E1等基因,使腺病毒载体成为复制缺陷病毒,并且减少转化宿主细胞的可能性。它能高效地感染分裂期和非分裂期细胞,并且能够插入较大的外源基因片段。腺病毒载体常引起宿主抗病毒免疫反应,不能整合宿主基因组,也不能长期表达外源基因。

依赖性病毒属(dependovirus)即腺病毒伴随病毒属(adeno- associated virus,AAV),属于微小病毒科。AAV不能独立繁殖,其繁殖依赖于辅助病毒,后者包括腺病毒和疱疹病毒。AAV载体有许多优点:可以感染所有的人类细胞,尚未发现野生型AAV有致瘤性,野生型AAV与宿主临床症状无关。野生型AAV倾向于整合进入人基因组第19号染色体。但如果去除rep基因,则AAV的整合变为随机整合,这就产生了在人类基因组有插入突变的可能性。

基因转染还有许多其他的手段,如基因枪和阳离子介导的基因转染等。可以根据不同的实验目的和实验要求,如瞬时转染或稳定转染、目的基因片段的大小等,选择不同的载体。

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