促凝辅因子:FⅤ、FⅧ、组织因子

凝血系酶性复合物中的辅因子蛋白,分成血浆促凝辅因子前体蛋白和细胞跨膜蛋白两种。

FⅤ、FⅧ

两种可溶性血浆蛋白FⅤ和FⅧ在形成维生素K依赖性蛋白复合物中起辅因子作用。FⅧa和Ⅴa分别与FⅨa和FⅩa在膜表面结合而发挥辅因子功能,加速后二者的酶解速率。先天缺乏这些蛋白产生先天性出血素质。FⅤ缺乏症曾称副血友病,FⅧ缺乏症称为血友病A。患者的出血表现与先天性丝氨酸酶原蛋白FⅨ、FⅩ缺乏症等同。

FⅤ基因位于1号染色体长臂(1q21~25),FⅧ基因位于X染色体长臂(Xq28)。FⅤ及FⅧ基因长分别为80、180kb;mRNA为6. 8、9kb。两者的基因结构及氨基酸顺序十分同源。FⅤ含24个内含子,FⅧ25个。除FⅧ第6内含子外,两者的内含子-外显子交界区序列均相同,但FⅧ基因大于FⅤ。FⅧ基因是已知基因中最大者。图1简介FⅤ功能区,方框顶部箭头代表凝血酶的裂解位点(709,1018,1045),方框下的箭头代表被活化蛋白C (APC)灭活时裂解位点(306,506)。图2简介FⅧ功能区。方框上箭头指出凝血酶和FⅩa使FⅧ活化成FⅧa时的裂解位点。方框下箭头代表APC灭活时裂解位点。FⅤ及FⅧ分子自N端起的功能区都有2个A区、B区后有一个A区以及2个C区(名A1、A2、B、A3、C1、C2区)。B区两者很不相同且有种系差异。人和牛FⅤ的B区显著不同。两种蛋白B区都高度糖基化。FⅧB区含19个天门冬酰胺连有糖基,很不稳定,部分分子的B区有不同程度的裂解。B区功能不十分明了,但活化时能释放出活性肽,故该区可能与发挥辅因子活性有关。然而FⅤ活化过程中只当被凝血酶和FⅩa除去B区后才能参与酶-辅因子复合物的形成。两种蛋白A区都和铜蓝蛋白功能区高度同源。FⅤ及FⅧ分子存在单个铜离子提示它们可能具有氧化酶或过氧化物酶活性,这点尚未获证实。

血浆中FⅤ(Mr 330 000)由2196个氨基酸组成,半衰期0. 5天。FⅤ也存在于血小板α颗粒中,在血小板活化时被释出。血浆FⅤ水平20nM(5~10mg/L)以单链前体蛋白形式存在。牛主动脉内皮细胞、Hep G2(肝癌细胞株)和豚鼠巨核细胞都曾有合成FⅤ的报道。FⅤ精氨酸713、精氨酸1536位被凝血酶或FⅩa酶解,去除B区,即产生FⅤa及2个高度糖基化的活性肽。人FⅤa是异二聚体,重链(Mr 105 000)含A1A2及NH2端,轻链(Mr 7400)含A3- C1- C2及羧基端。亚单位通过依赖二价金属离子的机制非共价联结。FⅤa无酶活性,作为辅因子在Ca2+存在下,形成膜磷脂-Ⅹa-Ⅴa复合物而加速FⅩa的催化能力。FⅤ和FⅤa与膜磷脂的结合本身不依赖Ca2+。FⅤ与丝氨酸磷脂有高亲和力而FⅤa的羧基端轻链(A3C2区)具有功能位点,能与血小板膜阴性磷脂特异结合。轻链还含有FⅩa、APC结合部位(受体),但FⅩa与FⅤa的相互反应同时需轻链和重链。FⅤa重链中有凝血酶原结合部位,是FⅤa起FⅩa辅因子功能的关键所在。FⅤa 轻-重链间二硫键见图3。FⅤ和FⅧ的许多半胱氨酸相同。FⅤ、FⅧ两者A区共同特征为都具有27个氨基酸,以二硫键桥形成a圈;此外,A1A2区含大的由二硫键桥组成的B圈;C区为由C1C2特大的两个二硫键圈组成。人和牛FⅤa的二硫键桥相等,人和牛FⅤa游离的半胱氨酸都在538、589、1953和2100位与蛋白功能有关。

 图1 凝血因子Ⅴ功能区示意图

图1 凝血因子Ⅴ功能区示意图

 图2 凝血因子Ⅷ功能区示意图

图2 凝血因子Ⅷ功能区示意图

凝血因子Ⅴa重链和轻链

 图3 凝血因子Ⅴa重链和轻链

图3 凝血因子Ⅴa重链和轻链

血浆中FⅧMr 285 000,血浆中FⅧ重链与大分子多聚体蛋白血管性血友病因子(vWF)联成二聚体使FⅧ分子获稳定。人FⅧ主要在肝内合成,血浆FⅧ由2332个氨基酸组成是由B- A3连接点及B区的不同程度酶解后形成的异二聚体,重链(Mr 90 000~200 000)含A1A2区或B区,轻链(Mr 80 000)含A3- C1- C2区。FⅧ被α凝血酶在精氨酸372位(A- A2连接点)、精氨酸740位(A2- B连接点)裂解;凝血酶并进一步裂解轻链精氨酸1648使释出vWF辅因子而产生FⅧa。FⅧa是异三聚体,由重链中A1区(Mr 50 000)A2区(Mr 40 000连带部分轻链)以及轻链A3C1C2区包括羧基端(Mr 74 000)所组成,三种亚单位以Me2+依赖的过程非共价结合。FⅧa一旦形成在溶液中很不稳定,主要是因为A2与其他区的联合较弱,A2亚单位解离伴FⅧa失活。

FⅤa和FⅧa可被活化蛋白C(APC)所灭活,A1A2区间裂解反应需在膜表面进行。APC一旦结合轻链2009~2018位APC结合部位,即能裂解FⅧa重链多个位点,精氨酸336(A1- A2连接点)、562(A2区内)、740(A2- B连接点),使FⅧa失活,先在A2区裂解能增强这一反应。

FⅤ、FⅧ蛋白合成后的修饰包括丝氨酸和苏氨酸糖基化和酪氨酸的硫化作用。FⅤ、FⅧ的磷酸化作用主要通过血小板衍生的蛋白激酶。

组织因子

组织因子(tissue factor,TF)是已知在血管损伤部位暴露出来的膜结合糖蛋白。TF是FⅦ的受体,血浆丝氨酸蛋白酶FⅦa的辅因子。TF和FⅦa两者需结合才能启动凝血瀑布反应。除血管壁组成中存在TF外,广泛分布于不同的组织细胞中如脑、肺、胎盘及白细胞。血液中的单核细胞和血管内皮细胞受多种细胞因子攻击下可诱生TF,使内皮完整的血管内由于细胞表达组织因子而促发凝血应答反应。12kb长的TF基因位于1号染色体、编码2. 3kb mRNA及复制蛋白质。人TF含263个氨基酸(Mr 45 000),有3个功能区:N端胞外区(219个氨基酸),跨膜区(或称疏水区23个氨基酸,220~242位)及胞内区(21个氨基酸,243~256位),245位含一个半胱氨酸以硫酯键与软脂酰基、硬脂酰基脂肪酸共价联结,使跨膜区获稳定。TF有许多可供N-和O-联结的位点,但糖基部位尚不清楚。

TF与FⅦa反应不需Ca2+,然而TF家族的辅因子功能需阴离子来增强,使FⅦa- TF复合物对底物水解的速率增强2个数量级。故认为FⅦa酶蛋白活性的表达需要和辅因子TF结合。阴离子膜的功能为加强维生素K依赖性底物与膜的结合因而增强TF- FⅦa对底物(FⅩ、FⅨ)的水解,而不是直接影响FⅦa- TF的催化能力。

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