苯丙酮尿症(PKU)分型与发病机制

苯丙氨酸(phenylalanine,PKU)是一种必需氨基酸,食入的苯丙氨酸如未用于合成蛋白质,正常是通过酪氨酸途径降解,缺陷苯丙氨酸羟化酶或者它的辅酶四氢生物喋啶,会导致苯丙氨酸在体液中堆积。苯丙酮尿症是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)缺陷或活性减低而导致苯丙氨酸代谢障碍的一种遗传性疾病。在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见。本病遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现不均一,主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等,脑电图异常。如果能得到早期诊断和早期治疗,则前述临床表现可不发生,智力正常,脑电图异常也可得到恢复。

经典的苯丙酮尿症(classic phenylketonuria,PKU)是完全缺陷或几乎完全缺陷苯丙氨酸羟化酶所致,过量的苯丙氨酸经转氨作用成苯丙酮酸或者经脱羧反应成苯乙胺,这些及其后续的代谢物影响正常代谢,并损害了大脑。我国新生儿筛查自1985~2006年共有13 666 750例新生儿进行了苯丙酮尿症(PKU)筛查,检出患儿1170例,患病率为8.6/10万。全国PKU患病率相对较稳定。

苯丙氨酸是人体所必需的氨基酸之一。人体不能合成,要靠从饮食中摄取。苯丙氨酸在肠道吸收后进入血液循环,约一半被利用作为合成蛋白质的原料,另一半则在肝脏中经苯丙氨酸羟化酶氧化成酪氨酸。后者通过不同酶的作用可产生黑色素、甲状腺素和乙酰乙酸。如果肝脏中苯丙氨酸羟化酶缺陷则苯丙氨酸堆积于血循环中,部分被代谢为苯丙酮酸。苯丙氨酸和苯丙酮酸在血中堆积,则可导致对中枢神经系统的损害而引起苯丙酮尿症。

目前对PKU的分型尚未达成共识。根据PAH活性缺乏的严重程度可分为轻、中、重3型。重型指经典PKU,轻、中型患者对BH4负荷试验常有血中苯丙氨酸水平下降反应,而经典PKU则无反应。据此PKU又可分为对BH4有反应型和无反应型。有一些患者无PKU而只有血中苯丙氨酸水平升高,根据升高的程度可分为良性型和恶性型,后者病情较重。

PAH基因缺乏突变热点区

本病为常染色体隐性遗传病,PAH基因突变引起PAH酶活性缺如或减低。人的PAH基因定位于12q24.1,13个外显子,编码区长约90kb,编码约2.4kb的成熟mRNA。在3′端约一半的外显子排列比较密,5′端的外显子则被较大的内含子分开。PAH基因有9个多态性限制性内切酶位点:在基因的5′端有BgⅢ、PVUⅡ(a)和PVUⅡ(b),在3′端有EcoRⅠ、XmnⅠ、MSPⅠ(a)、MSPⅠ(b)、EcoRⅤ和Hind Ⅲ。

99%的高苯丙氨酸血症或PKU都是由PAH基因突变引起,只有1%是由于辅因子BH4生物合成或再生障碍所致。PAH基因突变可累及外显子和内含子,突变类型有点突变、插入或缺失、提前终止编码、剪接和多态性。突变的基因型有纯合子、杂合子和复合性杂合子。在全世界26个国家,81位研究者分析了3986条突变的染色体,确定了243种不同的突变。到1999年3月Zekanowski等在论文中指出:世界上PAH基因突变已达350种以上。该作者研究了编码PAH酶调节区:部分的外显子3突变可引起经典的PKU、轻度的PKU和轻度的高苯丙氨酸血症,后者的突变常位于71~94位的氨基酸残基。在我国报告的已确定PAH基因突变有20多种,约占PAH突变基因的80%,其中259C>T(48.3%)及286G>A(15.5%)为热点突变。大多数学者认为PAH突变的基因型与表型之间相关,只少数患者例外。部分患者PAH突变的基因型与表型之间的不一致可能是由于用以检查突变的方法或者表型分类不同所致。

PAH基因定位于12q24.1。可发生多种突变人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因定位于12q24.1。可发生多种突变,目前没有发现突变的热点区,突变位点刚发表分布于基因的全段。突变基因编码合成的PAH蛋白功能丧失或减低,使苯丙氨酸不能被氧化成酪氨酸而在血循环中堆积。酪氨酸是人黑色素合成的原料,也是甲状腺素和神经递质多巴胺合成的原料,另外色氨酸是合成神经递质血清素(5-羟色胺)的原料,而苯丙氨酸和苯丙酮酸的堆积还抑制色氨酸羟化酶活性使5-羟色胺生成减少。因此,肝中苯丙氨酸羟化酶缺陷还可引起色素脱失和神经递质多巴胺和血清素合成发生障碍,后者也是患者神经系统功能受损的因素之一。

PAH正常发挥作用还必须有辅因子的参与。其相关的辅因子有5、6、7、8-四氢生物蝶呤(5,6,7,8-tetra-hydrobiopterin,BH4),如果这种辅因子缺陷则也可引起高苯丙氨酸血症(hyperphenylalanine,HPA)或苯丙酮尿(phenylketonuria,PKU)。BH4的合成至少牵涉4种酶即甲醇胺胱氢酶、双氢蝶呤还原酶、三磷酸鸟苷环氢酶(GTP cyclohydrolase)和6-丙酮酰四氢蝶呤(6-pyruvoyl tetrahydropterin)合酶,而这些酶的缺陷均可引起BH4缺乏。因此,PKU可由PAH基因突变或BH4缺乏引起。

PAH活性取决于基因是否突变和BH4是否缺乏。一些研究表明PKU表型与其基因相关,有些PKU患者对BH4有反应;而另一些则无反应。据此可以对PKU进行分型。

不同国家和地区的PKU患者PAH基因突变有所不同,我国北方和南方人群PAH基因突变类型分布也不一致。我国广东东南和西部及其周围地区,对461 805个出生新生儿作了 PKU的筛查,PKU的发病率为1/66 000、HPA发病率为1/33 000、BH4缺乏发病率为1/461 815。

PAH突变导致酶分子折叠和寡聚化障碍

正常人PAH蛋白有折叠,并有铁结合位点。铁结合位点结构的保持与位于活性位点相关的三维结构中第349位的丝氨酸有关,该位点的丝氨酸对PAH结构的稳定性聚合和PAH的催化性质很重要。此酶与组成催化、四聚体化区的每个单聚体则都以四聚体结晶出来。四聚体化区的特性是具有与其他单聚体相互作用的交换臂,因而形成一反平行的盘旋卷,而且明显的不对称,这是由于在导致盘旋卷螺旋的螯合区有两个交替构型所引起。某些最常见的PAH突变即发生于催化区和四聚体区的交界处。根据人PAH催化区的晶状体结构,突变对折叠和单聚体寡聚体化的影响提供一种解析。

肝异常PAH蛋白的作用

不同的PAH基因突变类型使PAH活性受影响的程度不同,对PAH结构的影响也不一样。总结起来PAH基因突变可以引起PAH蛋白折叠缺陷、折叠和聚合为同种四聚体/二聚体能力缺陷、寡聚化功能缺陷、突变蛋白对热不稳定、限制性蛋白溶解敏感性增加、在细胞中的稳定性减低、降解时间和过程改变和催化活性降低等变化。各地区人群PAH基因突变类型的分布的不同可能反映PAH基因突变有多种机制,包括拓荒者作用(founder effect)、遗传漂流(genetic drift)、过度互换性(hypermutability)和选择(selection)。Jiang等认为还应考虑各地区的生物性因素和人口繁殖情况。

肝外异常PAH蛋白的作用

除了在肝脏细胞中表达外,在非肝脏组织中也有表达,包括肾脏、胰腺和脑。肾脏中PAH一级结构与肝脏中者一致,只是其调节不同于肝脏中的PAH,但在机体苯丙氨酸平衡中,肾脏的PAH可能起作用。

其他因素的作用

除了肝PAH活性缺如或降低可引起PKU外,还有PAH的辅因子BH4发生变化也可引起。BH4为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸羟化必需的辅因子。负责编码此物质的基因为6-pyruvoyltetrahydropterin合酶(PTPS)基因。如果这种酶基因发生突变则PTP缺陷,即使PAH活性正常,也可引起PKU。另一种可引起PKU的酶是二氢蝶呤还原酶。据此,PKU的发病牵涉至少3种酶基因,其中一个基因发生突变即可引起PKU。

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