为什么会有多种方法进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因检测?

答:目前编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的DNA一级分子结构已完全清楚,热点突变类型也较明确,因此可以用多种分子生物学技术对G6PD基因突变进行分析。常用于检测G6PD 基因型的方法有:

位点特异性的寡核苷酸探针杂交法:聚合酶链式反应(PCR)技术扩增特定基因片段,再与芯片上特异性核酸探针杂交以区分特定的基因型别的基因芯片诊断方法,也称为基因芯片法。芯片法结果判断已完全实现自动化,只能用于已知突变位点的检测。

突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation sytem, ARMS):ARMS又称等位基因特异性扩增是一种可以用来筛查任何已知点突变的方法,它操作简单快速,结果可靠,一次PCR就可以检出结果。成功关键在于引物设计。ARMS法是目前用于筛查已知突变最佳选择。

变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC):是一种新的DNA突变分析方法。检测G6PD时,在部分变性条件下,序列的变异可以形成野生型和变异DNA的杂交双链和纯合双链的混合体,不同的错配在同一给定温度下会显示出不同的结合稳定性。因而不同的DNA变异型形成可区分的杂交双链和不同的洗脱峰形式,在此基础上对基因型进行分析和解释。

荧光PCR熔解曲线法:采用荧光PCR的方法,根据不同突变类型PCR产物溶点差异,熔解曲线不同的特点,检测G6PD 基因突变。该方法实现了全程闭管、自动化操作和检测,具有操作简便、速度快、结果准确等特点,非常适合用于临床。

DNA直接测序法:Sanger测序法直接进行基因序列的分析,可用于已知和未知突变的检测,被公认为基因诊断的 “金标准”,与其他基因检测方法相比,Sanger测序法常被用作标准的鉴定方法以及最终确定突变确切位置和类型的手段。但由于该方法操作繁琐,流程长,工作量大,不适合用于G6PD已知突变位点的快速筛查。

目前,获得国家食品药品监督管理总局批准用于临床检测的试剂盒分别采用基因芯片法和荧光PCR溶解曲线法,这两种方法均只能检测已知突变类型。基因芯片法检测的试剂盒可检出7种常见突变。荧光PCR溶解曲线法检测试剂盒可检出12种常见突变,覆盖中国人群常见突变类型的95%。但当患者高度怀疑G6PD 基因突变,而又未检测出热点突变时,建议对患者的G6PD 基因进行直接测序,测序是G6PD缺乏症确诊检测最有价值的方法。

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