19世纪中叶,Bernard就发现,静止状态下,血流是由动脉灌流压力和唾液腺血管阻力决定的,很大程度上是由唾液腺交感神经系统的紧张程度决定的。

分布在唾液腺内的自主神经纤维可释放神经递质,称为第一信使。这些递质传递到细胞膜时,与其上的称为受体的蛋白质相结合,把这种细胞外信息转化为细胞内信息,也称第二信使,后者再经由细胞内信号传递系统,最终转化为细胞反应如蛋白质、水和电解质的分泌。这些复杂的信号传递过程常常涉及多种蛋白质、水溶性物质和脂类物质。唾液腺的各种细胞膜上有针对不同递质的特异性受体。刺激这些受体所激活的信号传递系统不同,所引起的生理反应也不同。迄今为止,已经证明有多种受体可引起唾液腺细胞的分泌反应,包括胆碱能受体、肾上腺素能受体、P2核苷酸受体和多肽受体。生理状态下,胆碱能受体是由副交感神经系统激活的,而肾上腺素能受体则为交感神经所激活。

胆碱能受体

分类

胆碱能受体分为烟碱受体(nicotinic receptor)和毒蕈碱受体(muscarinic receptor)两类。前者可形成离子通道,使阳离子进入细胞;后者通过异源三聚G蛋白而激活细胞膜上的磷酸肌醇信号传递系统。近年来已经证实,毒蕈碱类胆碱能受体至少有5种亚型。唾液腺细胞含有第1型和第3型,以第3型为主。

已知烟碱型胆碱能受体存在于神经及肌肉细胞,唾液腺细胞可能没有烟碱型受体。但是,由于给予分离的大鼠唾液腺细胞团烟碱可引起细胞内Ca2+浓度增高,有人认为唾液腺细胞可能含有烟碱型受体。后来,Zhang GH等(1996)研究证明,在分离的大鼠舌下腺分泌终端内仍存在有神经纤维末梢,而且这些末梢的突触仍有功能。由于神经末梢含有烟碱受体,在受到烟碱刺激时,突触释放乙酰胆碱,从而激活分泌终端细胞的毒蕈碱受体,引起Ca2+动员。当把分泌终端分解为单细胞时,烟碱引起的反应消失,而对乙酰胆碱的反应仍然存在。

受体的分布和密度

唾液腺的各种细胞,包括分泌终端、导管系统及肌上皮细胞,均有大量毒蕈碱受体。大鼠腮腺每个腺泡细胞膜有23 000个毒蕈碱受体。据分析,产生最大细胞反应只需激活1800个受体即可。可见腺泡细胞膜上的受体并不需要同时参与反应。这种现象的意义可能是少数不同来源的胆碱能传入纤维兴奋即可引起完全的细胞反应。大鼠下颌下腺细胞的毒蕈碱受体密度为257pmol/g蛋白质,解离常数为0. 45nM(表3-10)。

表3-10 大鼠下颌下腺自主神经受体的密度和亲和力

大鼠下颌下腺自主神经受体的密度和亲和力

细胞内的信号传递系统

刺激毒蕈碱型胆碱能受体可引起分泌终端细胞的水与电解质分泌以及肌上皮细胞的收缩反应,但导管细胞的反应尚不肯定,可能是抑制离子转运。这些作用是通过细胞内信号传递系统——磷酸肌醇信号系统实现的。毒蕈碱受体激动剂与受体结合后活化细胞膜内的三聚G蛋白。后者由三个亚单位构成,即α、β和γ亚单位。其中α亚单位是G。当受体结合激动剂时,G亚单位与β γ亚单位分离从而使α亚单位活化。后者激活磷脂酶C(PLC)。PLC至少有8种亚型,即β1、β2、β3、β4、γ1、γ2、δ1和δ2。G所激活的是β型亚单位。唾液腺细胞含有β1、β3和γ1、γ3四种亚型。PLC可催化分解细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)释放1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)。IP3与内质网膜上的IP3受体结合,引起Ca2+通道开放,迅速释出其中所储存的Ca2+,使胞质内Ca2+浓度骤然增高。二酰甘油则可激活蛋白激酶C,使多种细胞内蛋白质磷酸化。

肾上腺素能受体

分类

肾上腺素能受体分为α受体和β受体两大类。α受体又分为α1和α2两组。根据对抑制剂的敏感程度,α1受体又分为至少α1A、α1B、α1C和α1D四种亚型。α1A亚型对拮抗剂酚妥拉明和WB4101的亲和力比α1B亚型分别大40和20倍。后来在牛脑基因库中发现了一种新的α1受体,称为α1C受体。从大鼠脑基因库中发现了另一个新的亚型,其药理学特征与前三种亚型均不吻合,因而命名为α1D受体。α2受体也有类似情况,现在已命名的亚型为α2A、α2B、α2C和α2D。β受体又分为β1、β2和β3三种亚型。

受体的分布及密度

(1)α受体:成年动物的唾液腺细胞含有α1受体,但不含α2受体。发育中的不成熟细胞含有大量α2受体,意义不明。而且,在囊性纤维化时,唾液腺中的α2受体大量显现。囊性纤维化的动物模型可通过注射利舍平而造成。研究发现,给成年大鼠注射利血平7天后,唾液腺细胞中α2受体以高密度显现,而正常大鼠唾液腺细胞中并无这种受体。大鼠舌下腺细胞α1受体密度很低,刺激该类受体也不引起生理性反应。但成年大鼠舌下腺含有大量α2受体(表3-11)。进一步的药理学研究证明,舌下腺的α2受体属α2D亚型。大鼠下颌下腺α2受体分布在突触前,而不是突触后,提示其作用是影响纤维末梢的递质释放,间接影响唾液腺细胞分泌。

表3-11 大鼠唾液腺肾上腺素能受体的密度

大鼠唾液腺肾上腺素能受体的密度

(2)β受体:β受体广泛存在于腮腺和下颌下腺的分泌终端细胞及各种腺体的导管系统中,唯一例外的是舌下腺的分泌终端细胞的受体密度可能较小。

细胞内信号传递系统

激动α1和β受体所产生的反应完全不同。激动分泌终端细胞的α1受体引起水和电解质的分泌,而激动β受体则引起蛋白质的分泌。与之不同,激动导管细胞的α1受体可能抑制离子转运,而激动其β受体则激活离子转运。这些作用是通过激活细胞内不同的信号传递系统实现的。

(1)α1受体:一般认为,激动α1受体所引起的反应与激动毒蕈碱型胆碱能受体相同,二者均激活细胞内磷酸肌醇信号传递系统,但近年来这种理论受到有力的挑战。研究发现,α1受体可能激活完全不同的信号传递系统。首先,α1受体激动剂并不能引起大量IP3产生;其次,Ca2+释放反应也远小于乙酰胆碱所引起的反应;而且,激动α1受体常可引起更多的Ca2+内流。有人提出,α1受体所激活的细胞内第二信使可能是环二磷酸腺苷核糖(cyclic ADP-ribose)。

(2)β受体:与β受体相匹配的细胞内信号传递系统是G蛋白和腺苷酸环化酶。激动β受体激活细胞膜上的G三聚G蛋白。G与Gβγ亚单位分离后可激活膜上的腺苷酸环化酶,催化产生环磷腺苷(cAMP)。cAMP可激活蛋白激酶A(PKA),即依赖cAMP的PKA,后者可使胞质内多种蛋白磷酸化,从而改变它们的活性。

激动β受体所引起的细胞内第二信使的释放在不同类型的细胞中呈不同模式。刺激分泌终端细胞所引起的反应主要为cAMP生成,而刺激导管细胞则伴随着Ca2+动员。后者通常是由激动毒蕈碱受体、P2核苷酸受体及P物质受体引起的。这种现象在分离的大鼠下颌下腺导管细胞及人下颌下腺纹管细胞株A253中均观察到。同时激活cAMP和Ca2+两种信号系统的情况在唾液腺细胞并不多见,而且其意义也有待于进一步研究。

激动分泌终端细胞的β受体只引起cAMP增加,并不引起Ca2+动员,这已经为众所周知。但1988年,Horn等报道用异丙肾上腺素刺激大鼠腮腺腺泡细胞β受体引起大量Ca2+释放,而且这种作用是由IP3为第二信使的。这在腺泡细胞信号传递系统研究领域引起了争论。后来,Hughes等(1989)对此进行了专门实验,发现该研究使用超大剂量的异丙肾上腺素,从而激动了腮腺腺泡细胞的α1肾上腺素能受体。已知后者是由IP3为第二信使,从而激活Ca2+动员。这种作用可被α1受体拮抗剂所阻断,表明其作用并不是β受体引起的。

尽管如此,由于信号传递系统之间存在交叉作用或通讯(crosstalk),激活cAMP信号系统可使磷酸肌醇-Ca2+信号系统的反应发生改变。

P2核苷酸受体

分类、分布

P2核苷酸受体分为两大类,一类为P2X受体,另一类为P2Y受体。P2X受体至少有7种亚型,分别为P2X1-7。P2Y受体至少有5种亚型,分别为P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11。其中P2X7曾称为P2Z;P2Y1曾称为P2Y、P2T;P2Y2也曾称为P2U。P2X受体的7种亚型均可被ATP所激活,但UTP不能激活,所以后者常被用来鉴别是否是P2X亚型。P2Y的激动则较为复杂,P2Y1不能被ATP和UTP激活,事实上,ATP是拮抗剂。P2Y2和P2Y4可被ATP和UTP所激活。P2Y6则可被UDP激活,ATP作用微弱,而UTP也远不如UDP有效。P2Y11可被ATP激活,但不能被UTP激活。

分布:1982年,Gallacher首次证明P2受体存在于小鼠腮腺细胞,而且细胞外ATP可调节这些细胞的分泌过程。后来,众多的研究证明,有四种P2核苷酸受体亚型存在于唾液腺细胞中,即P2X4、P2X7、P2Y1 和P2Y2

细胞内信号传递系统

(1) P2X受体:这类受体可能没有细胞内信号系统与之相匹配,而是直接在细胞膜上形成离子通道。这种通道的选择性较差,体积小的阳离子如Na+、K+、Ca2+均可通过。P2X受体与ATP结合时通道打开,因此又称为ATP控制的离子通道(ATP-gated ion channel)。由于所有P2X受体亚型均可导致Ca2+内流,因而这些受体在非激动型上皮细胞胞质内Ca2+调节方面有重要意义。

(2) P2Y受体:这类受体均与细胞内磷酸肌醇信号传递系统相匹配。激动时激活细胞膜上的三聚G蛋白,其α亚单位是G,从而激活磷脂酶C,形成IP3和二酰甘油,最终导致细胞内Ca2+浓度的增高和PKC的活化。除此之外,有人提出P2Y1可激活G,从而抑制cAMP的产生。而P2Y11可能激活G,从而活化腺苷酸环化酶,导致cAMP形成,但这些作用还不完全肯定。

生物学意义

迄今为止,尚无体内研究证明P2核苷酸受体在唾液腺中的生理作用,也没有人报道这些受体在在体的和离体的完整唾液腺中有何作用。所有研究均使用分离的唾液腺片段、唾液腺细胞以及培养的唾液腺细胞株。其次,虽然正常的神经突触释放核苷酸,而且核苷酸已被广泛认为是一种神经递质,但由于细胞膜上均含有活性很强的膜外核苷酸酶,核苷酸可能很快就被分解,因而在生理状态下能否激活这些受体还不清楚。

然而,有一种现象值得注意。用分离的成熟的唾液腺节段或细胞进行研究,一般不易观察到很强的P2核苷酸受体反应,但唾液腺细胞株却均对P2核苷酸激动剂呈现强烈反应。而且,发育中的不成熟细胞也呈现较强的反应,提示这些受体可能和发育过程有关。例如,P2Y1受体在出生时浓度很高,随发育过程而减低,到发育成熟时再也检测不到。如果分离成年动物的大唾液腺细胞,进行体外培养,P2Y2受体就会大量增加。此外,如果结扎下颌下腺的主排泄管,P2Y2受体也会大量增加。这些现象说明,P2核苷酸受体可能与发育、组织损伤后的再生和修复过程有关。其具体作用和详细机制均有待阐明。

肽类受体

支配唾液腺的神经末梢突触也合成和释放一些肽类递质,最常见的有VIP、P物质、神经肽Y、CGRP等。研究证明,VIP和P物质在唾液腺分泌过程中起重要作用。

VIP受体

VIP是1971年从猪小肠中分离出来的。此后,大量研究证明,它存在于许多组织中。猪VIP是一种碱性单链多肽,含28个氨基酸残基。它的主要生物学作用是使平滑肌特别是血管平滑肌松弛,以及刺激腺体分泌。

(1)分布:唾液腺的VIP来自支配唾液腺的节后副交感神经纤维。它一般与乙酰胆碱、P物质及NO等共存于突触内。近来的研究发现,VIP也存在于交感神经纤维末梢中。这些纤维分布在人下颌下腺分泌终端和导管周围。有些纤维分布在分泌终端细胞之间,而且大部分纤维分布在黏液性小管周围,浆液性腺泡周围则较少。这种现象也存在于大鼠下颌下腺和腮腺以及人唇腺。牛腮腺是否对血管活性物质起反应尚有争议。

VIP受体存在于许多组织中,其分子量大小取决于所在的种属及组织类型。已经检测过的组织有大鼠脑、人脑,大鼠、人、豚鼠、家兔肺,大鼠胰,大鼠和猪肝,人和大鼠的小肠等。而且,许多细胞株也被详细研究过。VIP受体的分子量一般在43~80kDa。受体所含的二硫键在与激动剂的结合中起重要作用。VIP受体与VIP的亲和力很高,解离常数为1nmol/L。然而,唾液腺细胞的VIP受体还没有被分离鉴定。

(2)细胞内信号传递系统:激动VIP受体引起三聚G蛋白(G)的激活,从而活化腺苷酸环化酶,引起cAMP生成。

(3)生物学作用:唾液腺中的VIP受体受激活时主要产生三种反应:直接刺激唾液分泌、增加唾液腺血流量及加强副交感神经所引起的分泌反应。用VIP刺激大鼠唾液腺如下颌下腺和舌下腺可引起小量唾液分泌。这种唾液富含蛋白质,表明是cAMP信号系统的作用。这种分泌反应不受交感及副交感神经拮抗剂如心得安和阿托品的影响,因而称为非肾上腺素能非胆碱能作用。同时,VIP亦可使唾液腺血管扩张,血流量大大增加,这无疑可促进唾液分泌。大量研究表明,VIP与胆碱能激动剂有协同作用,前者使后者的分泌反应大大增强。

P物质受体

P物质受体是1931年首次发现的,当时并不了解其结构。1934年命名为P物质。直到1971年,其结构才得以确定。它的分子量为1340,由11个氨基酸残基构成。20世纪70年代末到80年代初,它被归类到速激肽(tachykinin)系族内。在哺乳动物肽类中,也称为神经激肽(neurokinin)。神经激肽受体有三种,称为神经激肽受体1~3型(NK-1、NK-2、NK-3),其中NK-1对P物质有最高亲和力,故也常被称为P物质受体。所有三种神经激肽受体均为小分子量蛋白质,含有350~500个氨基酸残基,在细胞膜上的结构与视紫质相似。

(1)分布:P物质是由副交感神经纤维终末合成释放的,它一般与乙酰胆碱、VIP等神经肽共存。人和大鼠的腮腺、下颌下腺、舌下腺、舌腺均有P物质及P物质受体存在。豚鼠腮腺也有含P物质的神经纤维分布。人腮腺内含P物质的神经纤维明显低于含VIP及神经肽Y的纤维。含P物质的纤维在纹管和排泄管周围也很少。然而,大鼠舌腺的浆液细胞和排泄管细胞周围有密集的含P物质的纤维分布。唾液腺血管周围也有大量P物质纤维。包绕在大鼠舌下腺的浆液细胞和导管细胞外的肌上皮细胞附近也有密集的P物质纤维。

(2)细胞内信号传递系统:与P物质受体相匹配的信号传递系统是磷酸肌醇系统。激动细胞膜上的P物质受体就激活三聚G蛋白,使磷脂酶C活化,催化产生IP3和二酰甘油。其最终环节是Ca2+活化和PKC的激活。P物质受体亦可激活磷脂酶D。

(3) P物质受体的脱敏:P物质受体的一个鲜明特点是迅速脱敏化(desensitization)。当受体受到激动时,细胞内信号传递系统的激活一般只保持1~2分钟。而脱敏作用却持续1~2小时,即除去激动剂之后,需要1~2小时才能恢复反应。脱敏反应的机制尚不确定。一般认为是PKC活化的结果,但尚有争议。

(4)生物学作用:P物质有多种功能,但在唾液腺中的功能及意义尚不清楚。

CGRP受体

CGRP是一种37个氨基酸的酸性神经肽,于1982年首次发现,后来证实这种多肽存在于神经系统中。大鼠CGRP以两种形式存在,分别称为α-rCGRP和β-rCGRP,二者只有一个氨基酸残基不同。人CGRP也有两种形式,称为α-hCGRP和β-hCGRP,二者有三个氨基酸的残基不同。CGRP也存在于几种内分泌组织中,如甲状腺、肾上腺、胰岛,其他组织如心脏、回肠也可能含有。

(1)受体分类:一般认为CGRP受体有两个亚型,即CGRPR1和CGRPR2。前者对CGRP-(8-37)有亲和力,但不能被CysACM-CGRP所激活。后者对CGRP-(8-37)亲和力较低,但可以被CysACM-CGRP激动。

(2)在唾液腺中的分布:CGRP主要由感觉神经末梢合成释放,而副交感神经亦可合成分泌少量。因为它通常与P物质共存,常被认为主要由副交感神经纤维产生。CGRP在唾液腺中的分布尚不完全清楚。人下颌下腺中含CGRP的神经纤维比较稀疏,而在腺体内的分布也有争论。有的研究发现含CGRP的纤维分布在腺泡周围,另一些研究则未观察到这种分布。豚鼠腮腺和下颌下腺中含有CGRP,但舌下腺则不含有。CGRP受体的分布亦有待确定。

(3)细胞内信号传递系统:CGRP受体激动的主要细胞内反应是cAMP生成,这可能是由三聚G蛋白激活腺苷酸环化酶引起的。另外也有报道认为,CGRP可活化K+离子通道。

(4)生物学作用:CGRP的生物学功能不完全清楚,可能与葡萄糖代谢、体液调节有关。它在唾液腺中的意义尚不明了。给大鼠静脉注射CGRP引起短暂而明显的唾液腺血流量增加(43%),这种作用小于VIP的作用,后者引起血流量增加166%。注射CGRP并不能引起唾液分泌。但是在注射CGRP后20秒时给予毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱使唾液分泌明显增加,比单纯注射卡巴胆碱增加60%。这些结果说明CGRP可增强副交感神经激动剂所引起的唾液分泌。

支配唾液腺的神经纤维亦可合成释放其他神经肽,如神经肽Y,但其生物学意义尚有待于进一步阐明。

瞬时受体电位通道TRPV1和TRPV4

瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)最初用于描述一种短暂的电位反应,现在常指一个离子通道大家族,共有30多个成员,均为受体阳离子通道。TRP通道最早是在果蝇中发现的。后来发现这些通道存在于哺乳动物和人的许多组织,有极为重要的生理功能。

分类:哺乳动物的TRP通道分为7个亚族,即TRPC、TRPM、TRPV、TRPA、TRPP、TRPML、TPN。其中,TRPV亚族又分为TRPV1~TRPV6。TRPV1又称为Ⅰ型辣椒素受体(vanilloid receptor type 1,VR1),是TRPV亚族中第一个被鉴定的受体,也是研究最多的TRP受体。

结构

所有的TRP通道都有6个跨膜区(S1~S6)与一个疏水区,构成阳离子可通过的孔道。大鼠的TRPV1 cDNA表明,TRPV1有2514个核苷酸,所编码的蛋白质有838个氨基酸,分子量为95kDa。人和豚鼠的TRPV1有839个氨基酸,分别有85%和87%的序列与大鼠相同,而人与豚鼠的TRPV1序列有86%相同。TRPV1含有3个PKA磷酸化位点与18个PKC磷酸化位点。TRPV4与TRPV1的氨基酸序列有40%相同,其肽链的立体结构与TRPV1很相似,都形成一个“悬挂的篮子”样式,长度为130Å,宽度为85Å。大约30%的肽链位于质膜中,70%在膜外,易与其他物质发生相互作用。

表达

TRPV1首次被发现是在背根神经节和三叉神经节的神经元中,后来发现它广泛表达在神经系统中,也表达在大鼠的膀胱上皮、肾、脾、新生鼠的心脏、胃黏膜、肥大细胞。人体内的表达水平较低,但更为广泛,包括肾、肺、肝、胰、小肠、胃、脾、睾丸、子宫。最近,Zhang Y等(2006,2010)发现,TRPV1也表达在家兔的下颌下腺。TRV4在脑和背根神经节中广泛表达,许多外周可激动组织也大量表达。此外,许多非激动组织中也有表达,包括胃、小肠、大肠。小鼠胃的迷走神经的传入纤维表达TRPV1、TRPV2、TRPV4。Liu等(2006)发现,TRPV4存在于人腮腺细胞株HSY和下颌下腺细胞株HSG以及从小鼠腮腺和下颌下腺分离的细胞。

激活

TRPV1可被多种物质激活。外源性激活物有辣椒素类化合物,包括辣椒素、reiniferatoxin、dianil。TRPV1是唯一可被辣椒素激活的通道。植物源性激活物还有大蒜与洋葱的提取物如大蒜素和蒜氨酸以及芥子油。动物来源的激活剂有蜘蛛与海蜇的毒素。激活的机制是共价修饰第157位的半胱氨酸残基。共价修饰的机制是作用于巯基或二硫基;用巯基还原剂二硫苏糖醇(DTT)可阻断大蒜素和蒜氨酸的作用。此外,某些可通过细胞膜的氧化剂如二酰胺、氯胺-T、Cu2+等可不可逆地共价修饰巯基而增强TRPV1的活性。质子浓度增高(即pH减低)、PKC活化、细胞内磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸[PI(4,5) P2]均可降低活化TRPV1所需的温度阈值,从而加强辣椒素的作用。内源性激活剂与调节剂包括多胺,例如精胺、亚精胺、腐胺都可直接激活TRPV1。已经证明,多胺在生理浓度下即可调节TRPV1的活性。钙调蛋白也参与TRPV1的激活。

三种蛋白激酶对TRPV1的活性有调节作用。PKA可磷酸化TRPV1第116位的丝氨酸和第370位的苏氨酸,使其对激动剂如辣椒素的敏感性减低。PKC可使TRPV1第502位和第800位的丝氨酸直接磷酸化,使其对辣椒素和H+的敏感性增强,减低激活所需的温度,在正常体温时激活并使机体产生疼痛的感觉。依赖Ca2+/钙调蛋白的蛋白激酶Ⅱ可使TRPV1的第502位的丝氨酸和第704位的苏氨酸磷酸化,调节辣椒素的结合,从而改变其活性。

TRPV4可被许多刺激激活,包括温度高于24℃,因此在生理状态下,TRPV4处于活化状态。其他因素如细胞容积增大、剪应力、内大麻素(endocannabinoid)、anandamide、花生四烯酸代谢物佛波酯等均可使之激活。TRPV4也可被PKC磷酸化而激活。

功能

TRP家族的成员均为离子通道,多数对Ca2+有通透性,有些对Mg2+有通透性。这些通道在多种细胞的Ca2+调节中起重要作用。大多数通道是Ca2+内流进入细胞的途径,有些可能为Ca2+从细胞内Ca2+池中释放提供通路。TRPV亚族中,TRPV1~4对Ca2+的通透性较小,与Na+的通透性比在1~10之间。TRPV1的Ca2+与Na+的通透性比(PCa/PNa)为10,而Mg2+与Na+的通透性比(PMg/PNa)为5,并呈现外向整流电流-电压关系。TRPV5/6是高度选择性Ca2+和Mg2+通道。TRPV1对二价阳离子的通透性取决于蛋白质孔区的一个天门冬氨酸残基。

用蚯蚓、果蝇、小鼠等动物进行的遗传学研究证明,TRP通道与很多生物功能有关,包括形成对温度、渗透压、气味、味觉、机械刺激、视觉、痛觉的感受。

(1) TRPV1受体:TRPV1受体对多种物理、化学刺激有反应,包括高温、细胞外液的pH减低、内源性化学物质等。TRPV1通道是痛觉与热觉感受及整合过程不可或缺的元素。TRPV1受体激动剂辣椒素被认为是一种神经毒物,其毒性作用是经自主神经及躯体神经痛觉纤维传入中枢。一般来说,TRPV1的反应与炎症过程有密切关系。TRPV1通道激活引起的Ca2+内流会导致神经元的过度兴奋。

最近俞光岩的实验室发现,家兔和人的下颌下腺分泌终端的浆液细胞和导管细胞表达TRPV1受体;用辣椒素刺激使细胞内Ca2+浓度增高,使细胞外信号调节酶(ERK)引起的磷酸化增加,并促进AQP5从胞质到质膜的转移。这些作用是特异性的,可被TRPV1的选择性拮抗剂所阻断。有意义的是,在唾液腺外皮肤应用辣椒素可明显改善自体移植的下颌下腺的分泌(Zhang Y等,2006;Ding等,2010;Zhang Y等,2010)。

(2) TRPV4受体:TRPV4受体通道的生物功能包括传递热感受、机械感受包括对剪应力的反应、维持渗透压、调节细胞Ca2+平衡。Liu等(2006)发现,TRPV4与AQP5在维持唾液腺细胞的容积的自稳态过程中起重要作用。小鼠和人的腮腺和下颌下腺细胞从容积扩张状态恢复需要Ca2+内流和水外流,其中Ca2+内流是经由TRPV4 Ca2+通道。TRPV4激活剂佛波酯类可引起用Ca2+内流,而TRPV4的选择性抑制剂钌红可阻断Ca2+内流。敲除TRPV4基因的小鼠(TRPV4-/-)的唾液腺细胞不能有效地调节低渗溶液所引起的细胞容积增大,表明TRPV4在唾液腺细胞中的作用。

γ-氨基丁酸(GABA)受体

GABA是哺乳动物神经系统中分布最广泛的抑制性氨基酸介质,存在于40%的神经元中。

分类

GABA受体分为三大类,分别为GABAA、GABAB和GABAC。前二者又分为不同的亚型。三种GABA受体均可被GABA所激活。此外,GABAA受体的激动剂还有蝇蕈醇(muscimol)、isoguvacine、TACA(trans-4-aminocrotonic acid),其选择性抑制剂为荷包牡丹碱(bicuculline)。GABAB是代谢性受体,与G蛋白耦联,主要影响腺苷酸环化酶活性。其激活剂除GABA外,还有baclofen,拮抗剂有CGP35348、CGP54626、SCH50911。GABAC受体是后来发现的,其结构与GABAA类似。

结构

GABAA受体是由5种不同家族的亚单位所构成,即α1~6、β1~4、γ1~4、δ、ε、π。每个亚单位有4个跨膜区。在第3与第4跨膜区之间有一个细胞内的环状结构,可被蛋白激酶磷酸化。脑中最丰富的GABAA受体的构成为α1β2γ2。GABAA受体的基因位于第4、5、15和X染色体。

GABAB受体是由GABAB1和GABAB2通过C末端的相互作用聚合而成。两个亚单位均有7个跨膜区。GABAB2的mRNA只表达在神经元,而GABAB1也表达在神经胶质细胞。

GABAC受体是由两个同源或类同源ρ亚单位构成。人的GABAC受体基因位于第6染色体。

生理功能

GABAA和GABAC受体构成Cl-通道,激活时导致Cl-内流,引起细胞超极化。GABAA和GABAC受体有许多不同之处。首先,激活这两种受体所需的GABA浓度(EC50)不同;GABAA为5~100μM,而GABAC受体为1~4μM。GABAA受体的Hill系数为2,而GABAC受体为3~5。GABAA受体在激活后很快失活,而GABAC受体的失活较慢。其次,Cl-通道的开放时间也不同;GABAA受体为25~30ms,而GABAC受体为150~200ms。此外,GABAA受体有几种其他物质的结合位点,包括苯二氮平、巴比妥、神经类固醇、荷包牡丹碱,而GABAC受体则没有这些位点。

GABAB受体与G蛋白耦联,激动时抑制腺苷酸环化酶,抑制突触前膜P型、Q型与N型电压依从性Ca2+通道,减低神经介质的释放,包括GABA、谷氨酸、多巴胺、肾上腺素、5-羟色胺。GABAB受体也抑制突触囊泡的融合,其结果也是抑制神经介质的释放。GABAB受体也引起K+外流,结果也是使细胞超极化。GABAB受体可被baclofen激活。

唾液腺的GABA受体

GABA受体不局限于中枢神经系统,也存在于外周组织。现已发现,肾、胰、睾丸、唾液腺均表达GABA受体。早在90年代就有人测出唾液腺含有GABA及其受体,例如大鼠腮腺GABA含量为10nmol/g组织,下颌下腺为14. 3nmol/g组织,但只有脑水平的0. 6%~0. 8%。

(1)分布:用免疫组化技术测定GABAA受体在大鼠唾液腺中的分布,发现下颌下腺的纹管和集合管周围表达GABAA受体中的γ1和γ2亚单位。最近,Kosuge等(2009)用免疫组化方法对GABA及其合成酶谷氨酸脱羧酶(GAD)在大鼠下颌下腺中的分布,发现GABA和GAD存在于分泌终端细胞周围;切断鼓索神经和切除颈上神经节使之明显减少,但未完全消失。这些结果表明,GABA及其合成酶主要分布在唾液腺的神经末梢中,而不在唾液腺的分泌细胞内。

(2)功能:用动脉灌流法给大鼠下颌下腺和舌下腺输入GABA(1μM)显著抑制电刺激鼓索-舌神经引起的唾液分泌。另一种GABAA受体激动剂蝇蕈醇(1μM)也明显抑制唾液分泌,而GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(1μM)和印防己毒素(picrotoxin) (1μM)可解除GABA或蝇蕈醇引起的分泌抑制。

用分离的大鼠腮腺分泌终端细胞测定GABAA受体对淀粉酶分泌的影响表明,GABA(1μM)和蝇蕈醇(0. 5μM)使异丙肾上腺素引起的淀粉酶分泌减低17%~18%,而GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱可使这种抑制恢复。

临床上常用的抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫及镇静催眠药物苯二氮平类可与GABAA受体结合并改变其活性。在异丙肾上腺素和GABA或蝇蕈醇处理的大鼠,再给予1μM安定(地西泮)或氯硝西泮可使腮腺分泌淀粉酶进一步减低,其机制可能是减低胆碱能或肾上腺素能受体与介质的亲和力。Ouchi等(2011)给大鼠注射安定[0. 4mg/(kg•d)]7天,使毛果芸香碱刺激的腮腺唾液分泌减低50%左右,其作用是增加胆碱能受体与介质的解离常数,但对最大结合力无影响。Tsukagoshi等(2011)发现,安定使唾液腺表达“安定结合蛋白”增加,后者是一种内源性外周型苯二氮平受体的配体,对中枢型苯二氮平受体有调节作用。

此外,神经类固醇孕烯醇酮(pregnenolone)也可与GABAA受体结合,发挥抑制作用。已知许多器官有类固醇合成酶,如CYP11A1,可合成小量类固醇。这些器官包括脑、性腺、视网膜、肺、肾、胰等。逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹研究表明,所有大唾液腺都表达孕烯醇酮合成酶CY11A1的mRNA和蛋白质,但水平低于大脑皮质和肾上腺。孕烯醇酮抑制大鼠下颌下腺唾液分泌(Miyashit等,2011)。在应激状态下,例如甲基丙胺戒断反应时,CY11A1在腮腺的表达增加2. 3倍、下颌下腺增加3. 5倍、舌下腺增加1. 6倍。临床使用上述药物时或在应激反应时唾液分泌减少,上述结果为这种现象提供了解释,也为研究药物对唾液分泌的影响开辟了新的视野。

综上所述,虽然现在还无法对唾液腺分泌终端和导管细胞是否表达GABA受体做出结论,但可以肯定,唾液腺内的神经纤维含有大量GABA受体。GABA受体的作用是抑制唾液腺的分泌反应,这也许是唾液腺激动与抑制平衡的主要调节机制。毋庸讳言,这种因素在以前的唾液腺分泌研究中未引起应有的注意。

一氧化氮(NO)信号系统

NO是第一种能够在哺乳动物体内传递信号的气体。1980年,Furchgott在用家兔动脉进行实验研究时首次发现NO舒张血管的作用,后来将其命名为血管内皮产生的舒张因子(EDRF)。早期认为,NO的主要作用是调节血流和血压。后来发现它有很广泛的作用。例如,它在中枢和外周神经系统中起调节介质释放的作用、参与免疫反应的调节、在血管生成中扮演角色、也涉及炎症与自身免疫病的发生发展过程。

NO合成酶及其分布

NO是在NO合成酶(NOS)作用下产生的。现在已有三种NOS被鉴定:一种是神经型NOS(nNOS),也称为脑型NOS或NOS1;另一种是诱导性NOS(iNOS)或NOS2;第三种为内皮型NOS(eNOS)或NOS3。这些名称与它们被发现的组织及早期测定的分布有关,但它们的实际分布已经远远超出名称的范围。例如,nNOS不仅仅存在于中枢与外周神经系统,也存在于肌肉和上皮组织。所有这三种NOS都利用L-精氨酸和分子氧来合成NO和瓜氨酸。合成反应需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)等物质的参与。

作用机制

NO的作用机制是与鸟苷酸环化酶的血红素成分结合,激活环磷鸟苷(cGMP)合成。cGMP有许多功能,例如作用于cGMP调控的离子通道、依赖cGMP的磷酸二酯酶、依赖cGMP的蛋白激酶(G激酶)等。NO也可使蛋白质亚硝基化,从而调节其活性。

唾液腺的NO来源

许多动物的腮腺和下颌下腺分泌终端周围的神经纤维含有nNOS,包括大鼠、家兔、雪貂、猫等。人腮腺的神经末梢也含有nNOS。唾液腺含有极为丰富的血管,因而也含有大量eNOS。一些最近的研究提出,唾液腺的腺泡细胞也可合成NO。大鼠腮腺细胞中的NOS是一种160kDa的蛋白质,大约74%是在胞质内,并与nNOS抗体有交叉反应。下颌下腺的nNOS只有少量是在腺泡细胞的胞质中,更多是在质膜的周围。蛋白印迹法及免疫定位测定发现,大鼠下颌下腺细胞没有iNOS,而eNOS只存在于唾液腺内的血管。但是,最近的报告显示,大鼠的下颌下腺有iNOS(Correia等,2010)。

尽管唾液腺细胞可能合成NO,但由于神经和血管产生大量NO,加之NO极易在组织内扩散,区别NO来自哪种组织是一个复杂的问题。事实上,唾液腺细胞能够产生多少NO仍不清楚。

唾液腺NO的功能与调节

NO在唾液腺中的功能仍有争议。多数研究聚焦在NO与细胞内Ca2+的关系。

(1) NO引起的Ca2+释放:NO供体S-亚硝基-N-乙酰-青霉胺(SNAP)释出的NO使腮腺分泌终端细胞内Ca2+增高,持续数分钟。这种增加与细胞外Ca2+没有关系,因为在没有Ca2+的溶液里细胞内的Ca2+增加并不受影响,表明Ca2+的来源是细胞内Ca2+池。NO引起的Ca2+释放与cGMP有关,因为抑制鸟苷酸环化酶显著减低Ca2+释放。cGMP可能并不直接作用于Ca2+池,而是通过激活G激酶。激活G激酶可影响两种Ca2+释放系统,一种是对IP3敏感的Ca2+池,另一种是对ryanodine敏感的Ca2+池。已知ryanodine受体激活剂是cADP核糖。有人推测NO引起的Ca2+释放是通过cADP核糖。G激酶有可能激活cADP核糖。腮腺有cADP核糖,也有对其敏感的Ca2+池,但现在还没有肯定的证据表明NO/cGMP /G激酶引起的Ca2+释放是由于cADP核糖。在腮腺细胞,NO/cGMP也激活IP3合成,从而引起Ca2+从IP3控制的Ca2+池中释放。

(2) NO与Ca2+内流:1997年就已发现,大鼠下颌下腺分泌终端细胞及导管细胞在碳酰胆碱刺激时的Ca2+内流是由NO激活的。用nNOS抑制剂7-nitroindazole(7-NI)处理可完全抑制碳酰胆碱引起的Ca2+内流。用NO清除剂血红素也可完全抑制Ca2+内流。与之相反,加入L-精氨酸或可通过细胞膜的cGMP可使Ca2+内流部分恢复。然而,NO引起Ca2+内流没有在任何其他细胞中观察到。

(3) NO与唾液腺的分泌功能:理论上讲,NO能够刺激液体分泌,因为它可引起细胞内Ca2+增高。另外,NO引起血流增加,后者是液体分泌的基础。然而,现在还没有这方面的直接实验证据。在大鼠、猫、雪貂,用NO合成抑制剂L-LAME预处理使副交感神经激动剂引起的唾液分泌及唾液中的蛋白质含量减低,提示NO可能改变副交感神经激动剂引起的液体分泌。NO对交感神经引起的分泌有无影响尚有争论。首先,交感神经几乎不表达NOS。而且,L-LAME并不影响交感神经刺激引起的大鼠下颌下腺的分泌,但使羊的腮腺分泌蛋白质减低。

(4) NO产生的调节:Suguya等(2001)发现,家兔腮腺细胞在受到乙酰胆碱刺激时,NO合成增加8倍,而P物质、VIP、α-肾上腺素能激动剂脱羟肾上腺素、β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素均不能引起NO产生。能使细胞内Ca2+升高的物质如毒胡萝卜素、Ca2+离子载体A23187均可使NO产生增加。相反,除去细胞外Ca2+抑制乙酰胆碱引起的NO合成,说明NO产生依赖于Ca2+。家兔腮腺分泌终端细胞与nNOS抗体有交叉反应,但导管细胞没有。用蛋白质分离方法提取分泌终端细胞质中的NOS,使之纯化8100倍。然而,Looms等(2000)测定了分离的大鼠腮腺的NO合成,发现用去甲肾上腺素刺激可使NO合成显著增加,而乙酰胆碱却未能引起这种改变。而且,NO合成与胞质Ca2+浓度并无直接联系。离子霉素引起细胞内Ca2+浓度增加,但并不增加NO合成。相反,去甲肾上腺素刺激引起cGMP产生,后者引起细胞内Ca2+释放。

这些实验之间的不一致是否是由于动物种类的不同还不清楚。由于唾液腺内含有丰富的神经纤维和血管,nNOS和eNOS是其固有成分,因此在实验研究中很难确定NO的来源。

(5)唾液腺炎症时NO的产生:Correia等(2010)发现,唾液腺在炎症状态下合成大量NO。将炎症诱导物脂多糖注入大鼠下颌下腺可引起持久的炎症。用免疫印迹法分析证明,其iNOS表达增加4倍。免疫组化分析显示,iNOS表达是在唾液腺细胞内。用小剂量乙酰胆碱刺激发炎的下颌下腺可引起唾液分泌大量增加,同时细胞内Ca2+增高。用iNOS抑制剂预处理可阻止这些改变。

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